Las pruebas bioquímicas primarias son usadas para determinar el género de la mayoria de las bacterias.  Actualizado: 2015

1. Tinción de GRAM.
2. Prueba de catalasa.
3. Prueba de oxidasa.
4. Prueba de oxidación/fermentación conocida como OF.
5. Motilidad.

Nota: Para identificar el género de las Enterobacterias se usan otras pruebas bioquimicas llamadas IMVIC que se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato.

Tinción de GRAM.

Fue creada en 1884 por el médico danes Hans Christian Gram, Esta tinción nos permite separar a la mayoría de las bacterias en dos grupos las gram positivas que se tiñen de color violeta y las gram negativas que se tiñe de color rosa. La diferencia en la tinción radica en las estructuras de la pared celular de las bacterias.

Pared celular de las bacterias Gram positivas.

En la imagen de arriba se observa la capa gruesa de peptidoglicano y la ausencia de lipopolisacaridos.Pared celular de las bacterias Gram positivas.

En la imagen de arriba se puede observar el entrecruzamiento de los ácidos teicoicos.

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Pared celular de bacterias Gram negativas.

Se observa  en la imagen de arriba el lipopolisacarido, y la poca cantidad de peptidoglicano.

Se observa en la imagen de ariba  el bajo contenido de péptido-glicano y el alto contenido de lipidos en forma de lipopolisacaridos.

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Reactivos usados en la tinción de Gram.

• Agua estéril para realizar el frotis.
• Cristal violeta también conocido como violeta de genciana.
• Safranina.
• Una mezcla de alcohol-acetona 1:1.
• Agua corriente para enjuagar.

Técnica de la tinción de Gram.

De preferencia la tinción debe ser realizada sobre un recipiente para que los desechos sean desechados adecuadamente.

Frotis bacteriano.

1. Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica hasta el rojo vivo y esperar a que enfríe un poco.
2. Tomar con el asa una gota de agua estéril y agregarla en un portaobjetos.
3. Flamear nuevamente el asa  y esperar a que enfríe.
4. Tomar con el asa un poco de muestra bacteriana a partir de una colonia aislada.
5. Después agregar la muestra en la gota de agua que esta en el portaobjetos y homogeneizar suavemente con movimientos circulares.
6. Esperar que seque al aire libre o poner durante uno o dos segundos con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar.

Tinción.

1. Agregar cristal violeta, solo el suficiente para que se cubra el extendido bacteriano.
   dejar actuar durante 60 segundos.
2. Agregar el lugol, solo el suficiente, dejar actuar durante 60 segundos.
3. Enjuagar con agua corriente.
4. Agregar una o dos gotas de alcohol-acetona e inmediatamente enjuagar con agua corriente.
5. Agrgar Safranina, solo la suficiente, Dejar actuar durante 60 segundos.
6. Enjuagar con agua corriente.
7. Dejar secar a temperatura ambiente.
8. Observar en un microscopio óptico con un objetivo 100X usando aceite de inmersión.

Resumen de los pasos de la tinción de Gram.

Bacilos Gram positivos en azul intenso a morado.

Bacilos Gram negativos de rojo a rosa.

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Fundamento de la tinción de Gram.

**Los lavados con agua tienen el objetivo de arrastrar mecánicamente el exceso de colorante y quitar el alcohol-acetona.

**El colorante cristal violeta es de naturaleza básica y por lo tanto tiene afinidad por sustancias cargadas negativamente como la pared celular de cualquier bacteria.por lo que bacterias Gram positivas y Gram negativas son teñidas de color violeta.

**Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijación de algún colorante sobre una superficie determinada, en este caso el cristal violeta aumenta su fijación a la pared célular bacteriana usando de mordiente al lugol, en la pared bacteriana el lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua lo que evita que se disuelva y se pierda el colorante durante el enjuague.

Ya sabemos que la pared de los Gram positivos son ricos en ácidos teicoicos no saturados estos muestran gran afinidad por los agentes oxidantes, todos los mordientes por ejemplo el lugol son agentes oxidantes y su efecto en general consiste en dar un caracter mas ácidez de los ácidos teicoicos lo que aumenta la afinidad de estos por el colorante básico cristal violeta.

 **La mezcla de alcohol-acetona es un disolvente orgánico que decolora la pared bacteriana disolviendo el complejo cristal violeta-lugol, esta decoloración no afecta a las bacterias Gram positivas, hay varias explicaciones al respecto, les menciono las dos más aceptadas.
-Una teoría dice: El alcohol-acetona, deshidrata la pared rica en peptidoglicano de los microorganismos grampositivos lo cual cierra los poros de la pared, propiciando una barrera que no permite la salida del complejo cristal violeta-lugol.

En la pared de las bacterias gramnegativas hay poco péptido glicano y una gran cantidad de lípidos estos últimos son disueltos por el alcohol-acetona, lo que permite el escape del complejo cristal violeta-lugol.

-Otra teoría dice: Las bacterias Gram positivas tienen una capa muy gruesa de peptidoglicano con gran cantidad de enlaces entrecruzados de ácidos teicoicos los cuales son poco solubles en alcohol-acetona formando una especie de barrera en la pared bacteriana que no permite la sálida del complejo cristal violeta-lugol por ende se retiene el cristal violeta-lugol en la pared en el proceso de decoloración.

**La safranina es un colorante catiónico que tiñe las paredes bacterianas ya que estas tienen compuestos cargados negativamente, por consiguiente las bacterias Gram negativas se tiñen de color rosa, sin embargo las bacterias Gram positivas no se tiñen debido  a que su pared célular esta saturada del colorante cristal violeta y esto no permite la entrada de la safranina.

Factores que considerar en la tinción de Gram.

–No se debe sobrepasar los tiempos de tinción y decoloración.
–Los cultivos viejos hacen que las bacterias Gram positivas se tiñan parcial o totalmente de color rosa.
–Hay que tomar en cuenta que el agua usada en el frotis se encuentre en el rango de Ph 7-7.8 ya que:
Los grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
Los gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.

DAR CLIC AQUI. Realiza la tinción de Gram de forma interactiva, recuerda realizar correcatamente los pasos. La prueba interactiva pertenece y se obtuvo del: Virtual Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan State University.

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Prueba de la oxidasa.

Esta prueba esta basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada citocromoC oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.

Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana, en las siguientes lineas se dara una breve explicación de la cadena respiratoria solo con la finalidad de entender de donde proviene y que realiza la enzima citocromoC oxidasa, entiendase que todo este proceso tiene la finalidad de producir ATP.

En la respiración hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones desde sus sustratos hasta llegar  al citocromoC, la enzima llamada citocromoC oxidasa le quita electrones al citocromoC, estos electrones son transferidos por la enzima al oxígeno siendo este el último aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente debido a que el oxígeno tiene un exceso de electrones puede atraer átomos de Hidrógeno formando dos posibles productos: Agua o peróxido de hidrógeno.

Reactivos usados en la prueba de oxidasa.

Se utilizan colorantes cromógenos que actúan como aceptadores artificiales de electrones que sustituyen de cierta manera al oxigeno usado por la bacteria, los más usados son:

• Tetrametil-p-fenilendiamina.
• Dimetil-p-fenilendiamina.
• Indofenol.

El reactivo basado en una disolución acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%, es el más común y recibe el nombre de reactivo de Kovacs. Este reactivo se puede impregnar en discos o fragmentos de papel filtro grueso. En el comercio ya se venden tiras o discos impregnados con el reactivo.

Fundamento básico: El reactivo de Kovacs es incoloro pero al ponerlo en contacto con la enzima citocromoC oxidasa cambia a un color morado debido a que el  tetrametil-p-fenilendiamina es una amina aromática y la oxidación de esta produce quinolonas de color morado-azulado. Para mayores detalles checa la bibliográfia en especial el libro de Mac Fadin.

Como realizar la prueba de la oxidasa.

• Se toma con un palillo grueso de madera una muestra bacteriana a partir de una colonia aislada proveniente de un cultivo de 24h.
• La muestra se pone en contacto con la tira o disco impregnado.
• Se debe observar una coloración morada en un lapso no mayor a 30segundos para que sea positivo, de lo contrario el resultado es negativo.

Control positivo: Pseudomonas aeruginosa.   Control negativo: Escherichia coli.        

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La carencia de color en el disco se interpreta como oxidasa negativa.

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Factores a considrerar en  la pueba de oxidasa.

• No considerar un resultado positivo después de 30 seg  ya que el oxigeno molecular del ambiente oxida al reactivo.
• No usar asa bacteriológica metálica ya que la mayoría de estas con tienen hierro y este es capaz de oxidar el reactivo dando nos falsos positivos.
• No realizar la prueba de bacterias que provienen de colonias obtenidas de medios de cultivos que contienen glucosa u otro carbohidrato ya que la fermentación del carbohidrato inhibe a la oxidasa dando como resultado falsos negativos en la prueba.
• Para realizar la prueba usar bacterias provenientes de medios de cultivo como son: Agar sangre, Agar BHI, agar tripticasa soya, agar nutritivo, agar Mueller Hinton.

Realiza de forma interactiva la prueba de oxidasa. La prueba interactiva pertenece y se obtuvo del: Virtual Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan State University.  http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/oxidase/oxidase_test/index.html

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Prueba de la catalasa.

Prueba de catalasa Realiza la prueba de catalasa de forma interactiva. La prueba interactiva pertenece y se obtuvo del: Virtual Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan State University.

Fundamento de la pruebe de catalasa.

 El peróxido de hidrógeno es el producto final del metabolismo oxidativo de carbohidratos, a esta vía metabólica recibe el nombre de metabolismo aerobio-oxidativo.

La acumulación del peróxido es muy toxico por lo que la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas exceptuando a Streptococcus sp.  producen una enzima llamada catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno obteniendo agua y oxigeno gas.

Técnica e interpretación de la prueba.

El reactivo utilizado en la prueba es el peróxido de hidrogeno al 30%, Hay diferentes técnicas para realizar la prueba la mas común es poner una gota de peróxido en el portaobjetos y posteriormente con un palillo plano tomar un poco de bacteria a partir de una colonia aislada, si se observa el burbujeo generalmente intenso significa que hay producción de oxígeno por lo tanto se entiende que hay presencia de la enzima catalasa., hay bacterias que dan una reacción positiva debil aunque son las menos.

Reacción de la catalsa.

Control  positivo:  Stahylococcus aureus

Control  negativo:  Streptococcus pyogenes

Burbujeo catalasa positivo, carencia de burbujeo catalasa negativo.

Prueba de oxidación y fermentación también conocida como OF.

Las bacterias ocupan diferentes vías metabólicas para obtener sus nutrientes y la energía, casi todas las bacterias consumen algún tipo de carbohidrato generalmente el mas utilizado por las bacterias es la glucosa, usan la vía oxídativa, fermentativa o ambas.

La vía  oxidativa utiliza oxígeno, un sinónimo es vía aerobia. El metabolismo fermentativo no utiliza oxigeno, sinónimo metabolismo anaerobio.

Ingredientes del medio OF.

Peptona.	2g
NaCl.	5g
D-glucosa.	10g
Azul de bromotimol.	0.03g
Agar.	3g
Fosfato dipotasico.	0.3g
Agua.	1000m

Ph debe ser 7.1, que dara un color verde en la preparación.

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Fundamento de la prueba bioquímica de OF.

El metabolismo oxídativo de la glucosa produce ácidos débiles, por lo tanto en la prueba bioquímica se utiliza de indicador el azul de bromotimol que tiene un vire de ph menor respecto al rojo de fenol, ya que son ácidos débiles se agrega una mayor cantidad de glucosa hasta el 1%,  para que se produzca una mayor cantidad de ácidos y se alcance mas fácilmente el vire del indicador.

El metabolismo de las peptonas produce sustancias alcalinas que podrían disminuir el Ph del medio evitando así evidenciar la presencia de los ácidos débiles producidos por la via oxidativa, para solucionar esto el medio tiene poca cantidad de peptonas hasta el 2% respecto a la D-glucosa.

Ph de vire del azul de bromotimol:  6-7 

Ácido: Amarillo   Alcálino: Verde.

En el tubo sin aceite: La producción de ácidos débiles reduciría el ph del medio esto será evidenciado gracias al indicador produciéndose una coloración amarilla en todo el tubo, aunque puede variar su intensidad.

En el tubo con aceite: La fermentación de la glucosa produce ácidos fuertes respecto a los que produce la vía oxidativa, ejemplo de estos ácidos son el ácido láctico, ácido fórmico, ácido acético, entre otros. El medio se acidifica y el vire del indicador da como resultado una coloración amarilla intensa en la totalidad del tubo.

Técnica de la prueba.

Se van a usar dos tubos, utilizando un asa recta la cual se flamea en el mechero, se puede enfriar en agar estéril, después se toma un poco de bacteria a partir de una colonia aislada posteriormente se inoculan ambos tubos por el método de picadura y finalmente se preparan las condiciones de los tubos;

Un tubo se cerrara su tapa de tal forma que quede floja con la intención de que entre algo de oxigeno, al segundo tubo se le agregara 1.5-2ml de aceite mineral estéril y la tapa se cerrara completamente, se incubarán durante 24h.

Inoculación por picadura.

Interpretación y lectura de la prueba bioquímica de OF.

Interpreatción de tubos amarillo, amarillo: Fermentador facultativo y se reporta como:  F

Interpreatción de tubos amarillo, amarillo: Fermentador facultativo y se reporta como:  F

Cuando el tubo abierto es amarillo y el tubo con aceite es verde se interpreta como reacción oxidativa y se reporta como:  O

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Control positivo oxidativo: Pseudomonas aeruginosa
Control positvo fermentador: Escherichia coli
Control sin cambios, no consume glucosa: Moraxella sp

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Prueba de motilidad.

La motilidad se puede observar por un crecimiento turbio lejos de la picadura realizada en la inoculación de los medios OF o en un medio SIM, este método es de confianza variable ya que la picadura se pudo haber hecho chueca o irregular lo que nos  darian falso positivo. Para evitar este factor se realiza la técnica de gota suspendida bacteriana.

Técnica de gota suspendida: Agregar sobre un portaobjetos una gota de solución fisiológica salina estéril, ponerle un poco de muestra bacteriana, homogeneizar de tal forma que la gota no se extienda mucho, ponerle encima un cubreobjetos al que previamente se le a puesto una base de 4 bolitas pequeñas de plastilina con el objetivo de evitar que aplaste totalmente la gota con bacteria, finalmente observar al microscopio con un objetivo de 40X.

Se alcanzan haber bacterias muy pequeñas y casi translúcidas moverse a velocidad variable, observar al menos de 5-10 bacterias recorrer todo el campo de visión para declarase una motilidad positiva. La mayoría de las bacterias motiles son de morfología bacilar o sea Bacilos., Pero no todos los bacilos son motiles.

Bibliografía consultada.

–Koneman, Diagnostico bacteriológico, texto y atlas a color, 6ed, Panamericana, Argentina, 2006.

–MacFadin, Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica, 3ed, Panarmericana, Argentina, 2003.

–Bailey y Scott, Diagnostico bacteriológico, 12ed Panamericana, Argentina, 2007.