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Las pruebas bioquímicas primarias son usadas para determinar el género de la mayoria de las bacterias.  Actualizado: 2015

  1. Tinción de GRAM.
  2. Prueba de catalasa.
  3. Prueba de oxidasa.
  4. Prueba de oxidación/fermentación conocida como OF.
  5. Motilidad.
Nota: Para identificar el género de las Enterobacterias se usan otras pruebas bioquimicas llamadas IMVIC que se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato.

Tinción de GRAM.

Fue creada en 1884 por el médico danes Hans Christian Gram, Esta tinción nos permite separar a la mayoría de las bacterias en dos grupos las gram positivas que se tiñen de color violeta y las gram negativas que se tiñe de color rosa. La diferencia en la tinción radica en las estructuras de la pared celular de las bacterias.

Pared celular de las bacterias Gram positivas.

Se observa la capa gruesa de peptidoglicano y la ausencia de lipopolisacaridos.Pared celular de las bacterias Gram positivas.
Se puede observar el entrecruzamiento de los acidos teicoicos
Se puede observar el entrecruzamiento de los ácidos teicoicos.

Pared celular de bacterias Gram negativas.

Se observa el lipolisacarido, y la poca cantidad de peptidoglicano.
Se observa el lipopolisacarido, y la poca cantidad de peptidoglicano.
Se observa bajo con tenido de peptido glicano y alto contenido de lipidos en forma de liposacaridos.
Se observa bajo con tenido de péptido glicano y alto contenido de lipidos en forma de lipopolisacaridos.

Reactivos usados en la tinción de Gram.

  • Agua estéril para realizar el frotis.
  • Cristal violeta también conocido como violeta de genciana.
  • Safranina.
  • Una mezcla de alcohol-acetona 1:1.
  • Agua corriente para enjuagar.

Técnica de la tinción de Gram.

De preferencia la tinción debe ser realizada sobre un recipiente para que los desechos sean desechados adecuadamente.

Frotis bacteriano.

  1. Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica hasta el rojo vivo y esperar a que enfríe un poco.
  2. Tomar con el asa una gota de agua estéril y agregarla en un portaobjetos.
  3. Flamear nuevamente el asa  y esperar a que enfríe.
  4. Tomar con el asa un poco de muestra bacteriana a partir de una colonia aislada.
  5. Después agregar la muestra en la gota de agua que esta en el portaobjetos y homogeneizar suavemente con movimientos circulares.
  6. Esperar que seque al aire libre o poner durante uno o dos segundos con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar.

Tinción.

  1. Agregar cristal violeta, solo el suficiente para que se cubra el extendido bacteriano.
    dejar actuar durante 60 segundos.
  2. Agregar el lugol, solo el suficiente, dejar actuar durante 60 segundos.
  3. Enjuagar con agua corriente.
  4. Agregar una o dos gotas de alcohol-acetona e inmediatamente enjuagar con agua corriente.
  5. Agrgar Safranina, solo la suficiente, Dejar actuar durante 60 segundos.
  6. Enjuagar con agua corriente.
  7. Dejar secar a temperatura ambiente.
  8. Observar en un microscopio óptico con un objetivo 100X usando aceite de inmersión.
Resumen de los pasos de la tincion de Gram.
Resumen de los pasos de la tinción de Gram.

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