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Pruebas bioquímicas primarias: Tinción de GRAM, prueba de catalasa, prueba de oxidasa, prueba de O/F y motilidad.

Las pruebas bioquímicas primarias son usadas para determinar el género de la mayoria de las bacterias.  Actualizado: 2015

  1. Tinción de GRAM.
  2. Prueba de catalasa.
  3. Prueba de oxidasa.
  4. Prueba de oxidación/fermentación conocida como OF.
  5. Motilidad.
Nota: Para identificar el género de las Enterobacterias se usan otras pruebas bioquimicas llamadas IMVIC que se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato.

Tinción de GRAM.

Fue creada en 1884 por el médico danes Hans Christian Gram, Esta tinción nos permite separar a la mayoría de las bacterias en dos grupos las gram positivas que se tiñen de color violeta y las gram negativas que se tiñe de color rosa. La diferencia en la tinción radica en las estructuras de la pared celular de las bacterias.

Pared celular de las bacterias Gram positivas.

Se observa la capa gruesa de peptidoglicano y la ausencia de lipopolisacaridos.Pared celular de las bacterias Gram positivas.
Se puede observar el entrecruzamiento de los acidos teicoicos
Se puede observar el entrecruzamiento de los ácidos teicoicos.

Pared celular de bacterias Gram negativas.

Se observa el lipolisacarido, y la poca cantidad de peptidoglicano.
Se observa el lipopolisacarido, y la poca cantidad de peptidoglicano.
Se observa bajo con tenido de peptido glicano y alto contenido de lipidos en forma de liposacaridos.
Se observa bajo con tenido de péptido glicano y alto contenido de lipidos en forma de lipopolisacaridos.

Reactivos usados en la tinción de Gram.

  • Agua estéril para realizar el frotis.
  • Cristal violeta también conocido como violeta de genciana.
  • Safranina.
  • Una mezcla de alcohol-acetona 1:1.
  • Agua corriente para enjuagar.

Técnica de la tinción de Gram.

De preferencia la tinción debe ser realizada sobre un recipiente para que los desechos sean desechados adecuadamente.

Frotis bacteriano.

  1. Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica hasta el rojo vivo y esperar a que enfríe un poco.
  2. Tomar con el asa una gota de agua estéril y agregarla en un portaobjetos.
  3. Flamear nuevamente el asa  y esperar a que enfríe.
  4. Tomar con el asa un poco de muestra bacteriana a partir de una colonia aislada.
  5. Después agregar la muestra en la gota de agua que esta en el portaobjetos y homogeneizar suavemente con movimientos circulares.
  6. Esperar que seque al aire libre o poner durante uno o dos segundos con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar.

Tinción.

  1. Agregar cristal violeta, solo el suficiente para que se cubra el extendido bacteriano.
    dejar actuar durante 60 segundos.
  2. Agregar el lugol, solo el suficiente, dejar actuar durante 60 segundos.
  3. Enjuagar con agua corriente.
  4. Agregar una o dos gotas de alcohol-acetona e inmediatamente enjuagar con agua corriente.
  5. Agrgar Safranina, solo la suficiente, Dejar actuar durante 60 segundos.
  6. Enjuagar con agua corriente.
  7. Dejar secar a temperatura ambiente.
  8. Observar en un microscopio óptico con un objetivo 100X usando aceite de inmersión.
Resumen de los pasos de la tincion de Gram.
Resumen de los pasos de la tinción de Gram.

Bacilos Gram positivos
Bacilos Gram positivos
Bacilos Gram negativos

Fundamento de la tinción de Gram.

**Los lavados con agua tienen el objetivo de arrastrar mecánicamente el exceso de colorante y quitar el alcohol-acetona.

**El colorante cristal violeta es de naturaleza básica y por lo tanto tiene afinidad por sustancias cargadas negativamente como la pared celular de cualquier bacteria.por lo que bacterias Gram positivas y Gram negativas son teñidas de color violeta.

**Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijación de algún colorante sobre una superficie determinada, en este caso el cristal violeta aumenta su fijación a la pared célular bacteriana usando de mordiente al lugol, en la pared bacteriana el lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua lo que evita que se disuelva y se pierda el colorante durante el enjuague.

Ya sabemos que la pared de los Gram positivos son ricos en ácidos teicoicos no saturados estos muestran gran afinidad por los agentes oxidantes, todos los mordientes por ejemplo el lugol son agentes oxidantes y su efecto en general consiste en dar un caracter mas ácidez de los ácidos teicoicos lo que aumenta la afinidad de estos por el colorante básico cristal violeta.

 **La mezcla de alcohol-acetona es un disolvente orgánico que decolora la pared bacteriana disolviendo el complejo cristal violeta-lugol, esta decoloración no afecta a las bacterias Gram positivas, hay varias explicaciones al respecto, les menciono las dos más aceptadas.
-Una teoría dice: El alcohol-acetona, deshidrata la pared rica en peptidoglicano de los microorganismos grampositivos lo cual cierra los poros de la pared, propiciando una barrera que no permite la salida del complejo cristal violeta-lugol.

En la pared de las bacterias gramnegativas hay poco péptido glicano y una gran cantidad de lípidos estos últimos son disueltos por el alcohol-acetona, lo que permite el escape del complejo cristal violeta-lugol.

-Otra teoría dice: Las bacterias Gram positivas tienen una capa muy gruesa de peptidoglicano con gran cantidad de enlaces entrecruzados de ácidos teicoicos los cuales son poco solubles en alcohol-acetona formando una especie de barrera en la pared bacteriana que no permite la sálida del complejo cristal violeta-lugol por ende se retiene el cristal violeta-lugol en la pared en el proceso de decoloración.

**La safranina es un colorante catiónico que tiñe las paredes bacterianas ya que estas tienen compuestos cargados negativamente, por consiguiente las bacterias Gram negativas se tiñen de color rosa, sin embargo las bacterias Gram positivas no se tiñen debido  a que su pared célular esta saturada del colorante cristal violeta y esto no permite la entrada de la safranina.

Factores que considerar en la tinción de Gram.

--No se debe sobrepasar los tiempos de tinción y decoloración.
--Los cultivos viejos hacen que las bacterias Gram positivas se tiñan parcial o totalmente de color rosa.
--Hay que tomar en cuenta que el agua usada en el frotis se encuentre en el rango de Ph 7-7.8 ya que:
Los grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
Los gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.

DAR CLIC AQUI. Realiza la tinción de Gram de forma interactiva, recuerda realizar correcatamente los pasos. La prueba interactiva pertenece y se obtuvo del: Virtual Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan State University.


Prueba de la oxidasa.

Esta prueba esta basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada citocromoC oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.

Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana, en las siguientes lineas se dara una breve explicación de la cadena respiratoria solo con la finalidad de entender de donde proviene y que realiza la enzima citocromoC oxidasa, entiendase que todo este proceso tiene la finalidad de producir ATP.

En la respiración hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones desde sus sustratos hasta llegar  al citocromoC, la enzima llamada citocromoC oxidasa le quita electrones al citocromoC, estos electrones son transferidos por la enzima al oxígeno siendo este el último aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente debido a que el oxígeno tiene un exceso de electrones puede atraer átomos de Hidrógeno formando dos posibles productos: Agua o peróxido de hidrógeno.

Reactivos usados en la prueba de oxidasa.

Se utilizan colorantes cromógenos que actúan como aceptadores artificiales de electrones que sustituyen de cierta manera al oxigeno usado por la bacteria, los más usados son:

  • Tetrametil-p-fenilendiamina.
  • Dimetil-p-fenilendiamina.
  • Indofenol.

El reactivo basado en una disolución acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%, es el más común y recibe el nombre de reactivo de Kovacs. Este reactivo se puede impregnar en discos o fragmentos de papel filtro grueso. En el comercio ya se venden tiras o discos impregnados con el reactivo.

Fundamento básico: El reactivo de Kovacs es incoloro pero al ponerlo en contacto con la enzima citocromoC oxidasa cambia a un color morado debido a que el  tetrametil-p-fenilendiamina es una amina aromática y la oxidación de esta produce quinolonas de color morado-azulado. Para mayores detalles checa la bibliográfia en especial el libro de Mac Fadin.

Como realizar la prueba de la oxidasa.

  • Se toma con un palillo grueso de madera una muestra bacteriana a partir de una colonia aislada proveniente de un cultivo de 24h.
  • La muestra se pone en contacto con la tira o disco impregnado.
  • Se debe observar una coloración morada en un lapso no mayor a 30segundos para que sea positivo, de lo contrario el resultado es negativo.

Control positivo: Pseudomonas aeruginosa.   Control negativo: Escherichia coli.        


El color azul-morado en el disco de oxidasa es una reaccion positiva.

La carencia de color en el disco se interpreta como oxidasa negativa.
La carencia de color en el disco se interpreta como oxidasa negativa.

Factores a considrerar en  la pueba de oxidasa.

  • No considerar un resultado positivo después de 30 seg  ya que el oxigeno molecular del ambiente oxida al reactivo.
  • No usar asa bacteriológica metálica ya que la mayoría de estas con tienen hierro y este es capaz de oxidar el reactivo dando nos falsos positivos.
  • No realizar la prueba de bacterias que provienen de colonias obtenidas de medios de cultivos que contienen glucosa u otro carbohidrato ya que la fermentación del carbohidrato inhibe a la oxidasa dando como resultado falsos negativos en la prueba.
  • Para realizar la prueba usar bacterias provenientes de medios de cultivo como son: Agar sangre, Agar BHI, agar tripticasa soya, agar nutritivo, agar Mueller Hinton.

Realiza de forma interactiva la prueba de oxidasa. La prueba interactiva pertenece y se obtuvo del: Virtual Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan State University.  http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/oxidase/oxidase_test/index.html


Prueba de la catalasa.

Prueba de catalasa Realiza la prueba de catalasa de forma interactiva. La prueba interactiva pertenece y se obtuvo del: Virtual Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan State University.

Fundamento de la pruebe de catalasa.

 El peróxido de hidrógeno es el producto final del metabolismo oxidativo de carbohidratos, a esta vía metabólica recibe el nombre de metabolismo aerobio-oxidativo.

La acumulación del peróxido es muy toxico por lo que la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas exceptuando a Streptococcus sp.  producen una enzima llamada catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno obteniendo agua y oxigeno gas.

Técnica e interpretación de la prueba.

El reactivo utilizado en la prueba es el peróxido de hidrogeno al 30%, Hay diferentes técnicas para realizar la prueba la mas común es poner una gota de peróxido en el portaobjetos y posteriormente con un palillo plano tomar un poco de bacteria a partir de una colonia aislada, si se observa el burbujeo generalmente intenso significa que hay producción de oxígeno por lo tanto se entiende que hay presencia de la enzima catalasa., hay bacterias que dan una reacción positiva debil aunque son las menos.

Reacción de la catalsa.
Control  positivo:  Stahylococcus aureus
Control  negativo:  Streptococcus pyogenes
 
Burbujeo catalasa positivo, carencia de burbujeo catalasa negativo.
Burbujeo catalasa positivo, carencia de burbujeo catalasa negativo.

Prueba de oxidación y fermentación también conocida como OF.

Las bacterias ocupan diferentes vías metabólicas para obtener sus nutrientes y la energía, casi todas las bacterias consumen algún tipo de carbohidrato generalmente el mas utilizado por las bacterias es la glucosa, usan la vía oxídativa, fermentativa o ambas.

La vía  oxidativa utiliza oxígeno, un sinónimo es vía aerobia. El metabolismo fermentativo no utiliza oxigeno, sinónimo metabolismo anaerobio.

Ingredientes del medio OF.
Peptona. 2g
NaCl. 5g
D-glucosa. 10g
Azul de bromotimol. 0.03g
Agar. 3g
Fosfato dipotasico. 0.3g
Agua. 1000m

Ph debe ser 7.1, que dara un color verde en la preparación.


Fundamento de la prueba bioquímica de OF.

El metabolismo oxídativo de la glucosa produce ácidos débiles, por lo tanto en la prueba bioquímica se utiliza de indicador el azul de bromotimol que tiene un vire de ph menor respecto al rojo de fenol, ya que son ácidos débiles se agrega una mayor cantidad de glucosa hasta el 1%,  para que se produzca una mayor cantidad de ácidos y se alcance mas fácilmente el vire del indicador.

El metabolismo de las peptonas produce sustancias alcalinas que podrían disminuir el Ph del medio evitando así evidenciar la presencia de los ácidos débiles producidos por la via oxidativa, para solucionar esto el medio tiene poca cantidad de peptonas hasta el 2% respecto a la D-glucosa.

Ph de vire del azul de bromotimol:  6-7 
Ácido: Amarillo   Alcálino: Verde.

En el tubo sin aceite: La producción de ácidos débiles reduciría el ph del medio esto será evidenciado gracias al indicador produciéndose una coloración amarilla en todo el tubo, aunque puede variar su intensidad.

En el tubo con aceite: La fermentación de la glucosa produce ácidos fuertes respecto a los que produce la vía oxidativa, ejemplo de estos ácidos son el ácido láctico, ácido fórmico, ácido acético, entre otros. El medio se acidifica y el vire del indicador da como resultado una coloración amarilla intensa en la totalidad del tubo.

Técnica de la prueba.

Se van a usar dos tubos, utilizando un asa recta la cual se flamea en el mechero, se puede enfriar en agar estéril, después se toma un poco de bacteria a partir de una colonia aislada posteriormente se inoculan ambos tubos por el método de picadura y finalmente se preparan las condiciones de los tubos;

Un tubo se cerrara su tapa de tal forma que quede floja con la intención de que entre algo de oxigeno, al segundo tubo se le agregara 1.5-2ml de aceite mineral estéril y la tapa se cerrara completamente, se incubarán durante 24h.

Inoculación por picadura.

Interpretación y lectura de la prueba bioquímica de OF.

Ambos tubos verdes se interpreta como OF: sin crecimiento o no consume glucosa. segun sea el caso.
Ambos tubos verdes se interpreta como: negativo  o no sacarolitico debido a que no consume glucosa.
Interpreatcion de tubos amarillo, amarillo fermentador facultativo y se reporta como, OF: F
Interpreatción de tubos amarillo, amarillo: Fermentador facultativo y se reporta como:  F
Cuando el tubo abierto es amarillo y el tubo con aceite es verde se interpreta como reacción oxidativa y se reporta como OF: O:
Cuando el tubo abierto es amarillo y el tubo con aceite es verde se interpreta como reacción oxidativa y se reporta como:  O

Control positivo oxidativo: Pseudomonas aeruginosa
Control positvo fermentador: Escherichia coli
Control sin cambios, no consume glucosa: Moraxella sp


Prueba de motilidad.

La motilidad se puede observar por un crecimiento turbio lejos de la picadura realizada en la inoculación de los medios OF o en un medio SIM, este método es de confianza variable ya que la picadura se pudo haber hecho chueca o irregular lo que nos  darian falso positivo. Para evitar este factor se realiza la técnica de gota suspendida bacteriana.

Técnica de gota suspendida: Agregar sobre un portaobjetos una gota de solución fisiológica salina estéril, ponerle un poco de muestra bacteriana, homogeneizar de tal forma que la gota no se extienda mucho, ponerle encima un cubreobjetos al que previamente se le a puesto una base de 4 bolitas pequeñas de plastilina con el objetivo de evitar que aplaste totalmente la gota con bacteria, finalmente observar al microscopio con un objetivo de 40X.

Se alcanzan haber bacterias muy pequeñas y casi translúcidas moverse a velocidad variable, observar al menos de 5-10 bacterias recorrer todo el campo de visión para declarase una motilidad positiva. La mayoría de las bacterias motiles son de morfología bacilar o sea Bacilos., Pero no todos los bacilos son motiles.

Bibliografía consultada.

--Koneman, Diagnostico bacteriológico, texto y atlas a color, 6ed, Panamericana, Argentina, 2006.

--MacFadin, Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica, 3ed, Panarmericana, Argentina, 2003.

--Bailey y Scott, Diagnostico bacteriológico, 12ed Panamericana, Argentina, 2007.

78 comentarios en “Pruebas bioquímicas primarias: Tinción de GRAM, prueba de catalasa, prueba de oxidasa, prueba de O/F y motilidad.

  1. Pingback: Neisseria meningitidis – Microbiologia para humanos

  2. Natalia

    Una pregunta: ¿tu sabes cuales son las bacterías Gram-negativas fermentadoras y lácticas?
    te agradecería mucho si me ayudas con ese dato 🙂

    Responder
  3. Leidy Ordoñez

    Buenas noches, quisiera saber si por favor me puedes colaborar es que tengo que identificar un bacteria con estas caracteristicas pero no he podido me dieron estos resultados

    Bacilos . Gram negativos

    * Indol - Positivo
    *Metil . Negativa
    *Vouges- Positivo
    *Citrato- Positivo
    *Sim
    Movilidad- Positivo
    Sh2- Positivo
    Indol - Negativo
    * Catalasa- Negativo
    * Oxidasa Negativo
    TSI
    Fermentación de glucosa con producción de gas

    Espero me puedas colaborar ya que es para mañana muchas gracias

    Responder
    1. sergio O'Hara

      los resultados de tus pruebas preliminares son importantes para saber por que rama te vas a ir

      Responder
    2. sergio O'Hara

      la oxidasa te ubica dentro de las entero-bacterias pero esa prueba de indol me confunde porque esta dos veces si el indol es positivo es proteus vulgaris pero si el indol es negativo hay mas opciones salmonella, arizona hinshawii, o proteus mirabilis si tubieses mas pruebas podriamos descartar mas otra cosa en el medio MIO se lee movilidad indol ornitina no reportaste ornitina si ornitina es negativo entonces es p vulgaris

      Responder
      1. mariam

        Proteus no es.... empezando que el no toma vía butilenglicólica, y la prueba Vp está positiva

        Responder
    3. Jefferson Gutierritos

      Basilos gram (-) y su agrupacion? Tiene que ver mucho

      Responder
  4. Chi Rivera

    Excelente aporte... Soy estudiante de fesc me ayudo bastante saludos

    Responder
  5. Jeick

    Hola muy buena información, me ha servido de mucho.
    Gracias y saludos.

    Responder
  6. Yas

    Hola, disculpa he tenido dificultades para iniciar a identificar bacilos Gram positivos.. qué pruebas adicionales me recomienas realizar?? y en qué medios crecerian mejor o es común aislarlos? Gracias

    Responder
  7. Valentino

    Con que resultados de pruebas bioquímicas puedo decir que las bacterias son enterobacterias?

    Responder
    1. Francisco Lopez

      Se realizan las pruebas IMViC (Rojo de metilo, Vogues Proskauer, Índol, movilidad, acido sulfhidrico, movilidad y citrato

      Responder
    2. Fatima

      Para empezar , lo primero a analizar es tu medio de cultivo para Enterobacterias es recomendable Agar MacConkey

      Responder
      1. Jefferson Gutierritos

        Tiene que ver mucho si es lactoss (+) o lactosa (-) y a parte que tipo de miestra es?

        Responder
  8. mexicanpsycho

    Hola! sólo una observación: en el texto bajo la primer figura que ejemplifica la pared bacteriana debe decir que se trata de bacterias Gram positivas 😉 Como consejo: revisar la ortografía y redacción antes de publicar una entrada. Saludos y gracias por la info!

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  9. queen

    una pregunta cual es el nombre de la prueba para identificar solubilizadoras de fosforo

    Responder
  10. andrea

    Hola, muchas gracias por la info, muy útil. Me gustaría saber la fuente del esquema del procedimiento de Tinción de Gram, ojala me puedas ayudar.!

    Gracias!!!

    Responder
  11. Carlos.

    Gracias amigo, esto es de gran utilidad ya que también estoy estudiando en la FESC. Por cierto quisiera mencionarte un pequeño error en el último parrafo de este texto, ya que dice: «Se alcanzan haber bacterias muy pequeñas» pero más bien que es: «a ver».

    Saludos.

    Responder
    1. Carlos.

      Aaah, y también sería bueno que pusieras tu nombre completo para poder citarte y así.

      Responder
      1. cototica

        hola no asesoras por correo? tengo muchas dudas sobre los mecanismos de resistencia bateriana

        Responder
        1. MicrobitosBlog

          Hola cototica. asesoro sin problema solo que tardo un poco en contestar mándame un mail con tu duda especifica.
          saludos.

          Responder
  12. yoly

    muy bueno cson pocos lo trabajo como este, especifico y supero claro. felicidades

    Responder
  13. Gerardo

    Maravilloso!! Ojala hubiera mas trabajos como el que hiciste, esto facilita la comprensión y el uso de los medios.

    Responder
      1. karen

        en verdad muchas gracias por tu aportacion, me ayudo bastante para mi tarea 🙂

        Responder
  14. violeta

    hola que tal violeta me encanto la informacion que pude sacar de tu pagina me gustaria consultarte un poco mas hacerca metodo prueba seriada para bacteria mesofilas aerobias

    Responder
  15. adry

    buen tema... 🙂 soy estudiante de biologia y este blog me parecio interesante, pues nos habla de los fundamentos de las pruebas... y era lo que buscaba. gracias colega!

    Responder
  16. Alexis Valadez

    Hola compañero de FESC, igual soy estudiante de la FESC de la carrera bioquimica diagnostica 🙂 buena explicacion de pruebas bioquimicas primarias podre pasar mi examen de labo 🙂 estaria perfecto si hicieras un apartado de las pruebas secundarias, creo lo tienes pero es muy general, lo podrias hacer un poco mas extenso pero buen aporte saludos

    Responder
  17. Sakura Otaku

    Muchas gracias por la ayuda 😀 me ayuda demasiado en mis clases de microbiologia 😀
    pero me quedo una duda.. las eneterobacterias son las Gram Negativas??

    Responder
    1. microbitos

      Las enterobacterias son Gram (-), aunque como todo en la vida hay alguna que rompe la regla, je
      saludos

      Responder
      1. IZM

        es un exelente trabajo... no habra uno de pruebas bioquimicas secundarias jajaa

        Responder
    1. microbitos

      Es mas probable que idintifiques eneterobacterias usando las pruebas IMViC (Indol, Rojo de metilo, V-P, y Citratos), busca en el blog hay una entrada que habla al respecto.
      saludos

      Responder
      1. Natalia

        Una pregunta: ¿tu sabes cuales son las bacterias gram-negativas fermentadoras y lácticas?
        te agradecería mucho si me ayudas con ese dato

        Responder
  18. sergio zuñiga

    EXCELENTE TRABAJO , QUE IMPORTANTE ES ENCONTRAR BUENOS TRABAJOS EN LA RED. FELICIDADES.

    Responder
    1. microbitos

      Gracias, espero te sirva y pues recomienda el lugar para hacer crecer nuestra comunidad.
      saludos.

      Responder
  19. leopoldo

    Gracias mil por tomarte el tiempo de recabar y compartir esta información. Saludos desde Durango

    Responder
  20. Alejan dra

    Cursos de microbiología para principiantes, donde te podemos contactar? muy buena presentación se despejarón dudas... gracias!

    Responder
    1. microbitos

      Asesorías de micro...me parece bien, me pueden contactar en mi correo electrónico que aparece en el blog.
      Excelente que despejaste algunas dudas!!
      saludos

      Responder
  21. Alberto

    buena informacion amigo, gracias saludos de un QFB de la Benemerita de Puebla.

    Responder
  22. Edgar

    Muchas gracias. De un IQ de la FESC tomando micro industrial! 🙂

    Responder
  23. Hisler Sadeck

    Gracias, muy buena pagina saludos de un Biologo del IPN

    Responder
    1. microbitos

      Gracias, espero sea de ayuda la informacion, y si quieren asesorias de algun tema en particular diganme y pues vemos que podemos ahcer.
      Saludos

      Responder
  24. MANUEL

    GRACIAS POR LA INFORMACION, ME ES DE MUCHA UTILIDAD

    Responder
  25. dorita

    Que sitio mas bueno, gracias por la informaciòn y tu tiempo. Gentileza agradecida.

    Responder
    1. microbitos

      Me da gusto que te guste el blog y que te sea de utilidad.
      Proximamente pondré cosas nuevas, si puedes recomienda el blog
      SALUDOS

      Responder

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