Hola a todos microbitosblog, se renueva, bacterias, agares, identificación, se actualizara y mejorara.

Soy Gil de microbitosblog, es un gusto anunciarte que el blog se renueva, se actualizara la información, se contestaran comentarios pendientes, se subirá nuevo contenido sobre identificación bacteriana, preparación de medios de cultivo, enfermedades infecciosas, morfologia colonial, microbiología básica e infantil; podcast, videos y libros cortos de microbiología; entre muchas cosas.

Poco a poco se va a actualizar la apariencia y contenido del blog si tienes ideas compártelas en los comentarios,

Muchas gracias.

Pseudomonas aeruginosa, P. putida, P. fluorescens; Morfología, medios de cultivo, enfermedades y más.

Características.

Pseudomonas spp. su morfología colonial es característica de identificación en algunos medios de cultivo, por ejemplo en medio agar Cetrimida, es un bacilo curvo o recto, aislado o en pareja o cadenas cortas, Gram negativa (-) esta bacteria tiene motilidad positiva gracias a su flagelo (solo cuenta con uno).

Tiene la capacidad de formar biofilm, tiene un ligero aroma a frutas y es una de las principales bacterias oportunistas causantes de infecciones nosocomiales nosocomiales, especialmente en heridas, quemaduras y cuando se presentan cepas mucoides hay una alta mortalidad en casos de fibrosis quística.

Taxonomía bacteriana

Filo: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Pseudomonadales
Familia: Pseudomonadaceae
Género: Pseudomonas

Antecedentes.

Schroeter (1872) le dio nombre de Bacterium aeruginosum, posteriormente en el año de 1894 el botánico alemán Wallter Migula da el nombre de un nuevo género llamado Pseudomonas , las describió como “células con órganos polares de la motilidad”.

Si nos referimos a la etimología griega pseudo (falso) y monas (unidad) osea “unidad falsa”, estas palabras no tienen mucha coherencia, Migula no hablo a cerca de la etimología del término, sin embargo se cree que tomo como base el hecho de que las bacterias que ya conocía eran unidades bacterianas (células individuales sin flagelo), por lo tanto las Pseudomonas son parecidas a las unidades bacterianas (bacterias sin flagelo), debido a esto podríamos interpretar el nombre como “unidad falsa” ya que una unidad verdadera no tiene flagelo, algo confuso pero hasta cierto punto tiene sentido.

Respecto a la etimología de Pseudomonas aeruginosa viene derivado de la palabra Aerugo (“el óxido de cobre o verdín” de color verde) y la palabra ōsus (indica abundancia) se llama así por el color azul verdoso de las colonias bacterianas.

Morfología microscópica.

Son bacilos cortos, en parejas, en cadenas o aislados, Gram (-), el flagelo polar monotrico no es visible en una tinción de Gram ya que el flagelo es muy delgado, para poderlo observar habrá que realizar un proceso de tinción especial llamado Tinción flagelar de Leifson-Clarck, generalmente el flagelo no se usa como identificación, sin embargo hay ocasiones que es necesario cuando las pruebas bioquímicas no son suficientes para identificar al género bacteriano te apoyas distinguiendo de las bacterias que no tienen flagelo.

Pseudomonas, Bacilos Gram negativo
En esta imagen se observa bacilos de cortos a largos, Gram (-), sin agrupación aparante.
Credito: Bacterioweb.

El tamaño de Pseudomonas está entre 0.5 μm y 0.8 μm de espesor por 1.5 μm y 3.8 μm de largo. No forma esporas.

Metabolismo bacteriano.

Tiene un metabolismo aerobio estricto-oxidativo, no fermenta carbohidratos, sus requerimientos nutricionales son sencillos prácticamente crece en agua.
Secreta sustancias coloridas hidrosolubles (1):

*Piocianina; Pigmento azulado.
*Pioverdina (Fluoresceína); tiene un color amarillo-verdoso ante luz UV es fluorescente.
*Piorrubina; Tiene una coloración roja y se favorece su producción a temperaturas menores a 37 °C y en un medio de cultivo con compuestos de hierro
*Piomelanina; Su color es marrón, aumenta su síntesis con temperatura menor a 37 grados Celsius y en ambiente con fuentes de Fe.

Pseudomonas_piocianina_fluoresceina_piorrubina_piomelanina
->Piocianina: azulado. ->Pioverdina (Fluoresceína): amarillo-verdoso.
->Piorrubina: roja. ->Piomelanina: marrón.
Credito: scielo
Pseudomonas_fluoresceina_luz_uv
En este medio de cultivo se muestra la fluorescencia de Pseudomonas sp. esta luminosidad se manifiesta en presecencia de luz uv, debido a la fluoresceina.
Credito: imageshack

Los diferentes pigmentos se pueden apreciar mejor sobre un agar Muller Hinton alrededor de 48 h de incubación a 28 °C.
Combinando la Piocianina con la Pioverdina se genera una coloración verde-azulado brillante.

Produce la enzima catalasa, oxidasa, utiliza diversas fuentes de carbono entre ellas el citrato, es capaz de reproducirse a temperaturas de 42°C (este fenómeno puede ayudar a la identificación del género), Es capaz de secretar toxinas extracelulares como exotoxina A y enterotoxinas.

Hábitat en humanos y modo de transmisión.

Hábitat: El género Pseudomonas prácticamente se encuentra distribuido en todas partes, por ejemplo en agua, suelos, vegetación, gasolina, objetos inanimados, en humanos, animales, etc.

Trasmisión: Por aire, el agua contaminada es buena fuente, es posible transmitir la bacteria, por medio de gotitas de saliva, en hospitales (nosocomios) en especial en aquellos que no cuenten con proceso de sanitización adecuado de áreas, equipos, médicos, enfermeras y/o personal que este en contacto con el paciente enfermo. El periodo de incubación oscila entre las 24h y 72h.

Medios de cultivo donde crece Pseudomonas spp.

Sus requerimientos nutricionales no son exigentes, por lo que crece en casi todos los medios de cultivos, exceptuando aquellos que sean selectivos para alguna especie en particular o que contengan antibióticos o sustancias que inhiban el crecimiento.

Su cultivo bacteriano se da en caldos o agares:

*Medio de cultivo base agar con Soya-Tripcaseína
*Caldo Nutritivo.
*Agar Cetrimida,
*Medio de cultivo base agar con sangre.

Pseudomonas_agar_sangre
Se muestra en la imagen colonias de Pseudomonas spp. sobre un medio de cultivo de agar sangre, se observa una coloración gris-plata en la superficie del crecimiento bacteriano.
Credito: Judy adam/flickr

*Agar Mueller Hinton.
*Caldo Casoy.
*Muchos más.

Pseudomonas aeuroginosa.

Es un patógeno que causa infecciones en personas inmunocomprometidas, como por ejemplo personas con quemaduras en la piel, pacientes que reciben quimioterapia para el cáncer, pacientes con fibrosis quistica, al tipo de infecciones antes mencionadas se le llama infecciones de un patógeno oportunista (aprovechar situaciones desfavorables del paciente para enfermar), también produce muchos casos de infecciones nosocomiales (en hospitales), como neumonías.

La bacteria es capaz de tener resistencia aun gran numero de antibióticos, P. aeuroginosa puede formar un biopelícula que facilita la resistencia a diversos tratamientos, además de que ayuda a evadir las defensas del sistema inmune del paciente.

Factores de virulencia.

Pseudomonas es un genero bacteriano con un alto potencial de patogenia, las “armas” que puede usar son muy eficientes para quebrar las defensas del sistema inmune, sobre todo en personas inmunocomprometidas.
Todos los días se hacen investigaciones sobre los factores de virulencia y se descubren cosas nuevas, en los siguientes párrafos mencionare los factores más comunes.

*Biopelicula: Esta formado de polisacáridos en particular por alginato, tiene múltiples funciones entre ellas puede retrasar o inhibir la entrada de los antibióticos en la bacteria, en algunos casos puede producir necrosis en los neutrofílos. Interfiere en la eficacia de las células fagociticas.
La mayoría de las cepas de Pseudomonas no son del tipo mucoide por ello producen muy poca biopelicula, sin embargo en pacientes con fibrosis quistica, se suele sintetizar grandes cantidades de alginato.
Se cree que casi todas las cepas que se encuentran viviendo en el medio ambiente forman biopelicula.

*Toxinas extracelulares, enzimas hidrolíticas y de lisis: Lipasas, Elastasas A y B, fosfolipasas, protesas alcalina, exotoxina A, Y, T y S .

*Biosurfactantes: Son sustancias que se comportan como tensoactivos teniendo una parte de la molécula con tendencia lipofílica y otra con tendencia hidrofílica, dicha sustancia tiene un efecto de disminuir la tensión superficial ayudando a “mojar ” con facilidad las superficies, en el caso de Pseudomonas sp. este biosurfactante esta constituido por ramnosa y lípidos.

Se tiene la teoría de que utiliza este tensoactivo para solubilizar compuestos hidrofóbicos como el hexadecagono, también favorece en la motilidad de la bacteria facilitando el desplazamiento por ambientes acuosos, entre otras.

*Pigmentos:

*Piocianina; Tiene efecto bactericida.
*Pioverdina; Se tiene la teoría de que actúa como un sideróforo (captación de hierro).
*Piorrubina; Se le adjudica actividad antibacteriana.
*Piomelanina; Se le atribuye función bactericida.

*LPS: Son estructuras que se encuentran sobre la superficie de la membrana bacteriana y están conformados por lipolisacáridos, tiene diversas funciones para evadir el sistema inmune entre ellas se encentra la inhibición de la eficiencia del sistema de la cascada del complementos, que es un conjunto de sustancias que se activan de manera sucesiva para lisar las membranas bacterianas, lps se interpone entre el complemento y la membrana bacteriana.

*Motilidad, flagelo y pilis: El movimiento de Pseudomonas se da por dos vías, la primera es dado en medios líquidos, donde utiliza su único flagelo polar, en ambientes semisólidos o superficies, se mueve a partir de los pilis (fimbrias) del tipo IV a este yipo de movilidad se le llama “twitching”.
Los pilis tambien juegan un papel importante durante la adherencia de la bacteria hacia las celulas a infectar.

*Sistema Sensor de Quorum: Este sistema regulatorio genético detecta cuándo se ha llegado a una masa crítica de bacterias, ademas promueve la síntesis de distintas proteasas involucradas en la virulencia de esta bacteria como son las elastasas A y B y la proteasa alcalina, así como la exotoxina S. Este sistema sensor se expresa siempre que se alcanza una elevada densidad celular bacteriana.

Infecciones causadas por P. aeuroginosa.

Esta bacteria tiene un gran arsenal de factores de virulencia por lo que su patogenicidad es alta, este microorganismo causa muchos tipos de infecciones, sobre todo en pacientes inmunocomprometidos y pacientes en nosocomios (hospitales), mencionare las infecciones más comunes.

*Infección de ojos. Principalmente queratitis (infección en la cornea), la bacteria se introduce en el ojo por medio de alguna herida, como por ejemplo la causada por un lente de contacto.

*Infección auditiva. Es una infección que se da en la zona exterior del oído, generalmente se adquiere después de nadar debido a que residuos de agua quedan depositados en los pliegues exteriores del oído.

*Pulmonía. Generalmente es una enfermedad nosocomial (adquirida en el hospital), aumenta el riesgo cuando recibe el paciente respiración artificial por medio de tubos, este tipo de infección tiene un alta mortalidad.

*Infección del sistema urinario. Al igual que la pulmonía las infecciones del sistema urinario suelen ser adquiridas en el nosocomio, y se relacionan con intervenciones quirúrgicas.

*Septicemia (presencia de bacterias en la sangre). Se puede adquirir debido a una herida gangrenosa o una lesión cutánea que implique nodulos (estructuras que filtran desechos de la sangre).

*Infección en quemaduras. Estas infecciones son muy comunes debido a que la piel quemada pierde su función de barrera y la bacteria encuentra una entrada de fácil acceso hacia el paciente y la producción de biopelicula aumenta la virulencia de las cepas de Pseudomonas causando infecciones graves que en ocasiones comprometen tejidos blandos del paciente.

*Infección de Pseudomonas en conjunto con fibrosis quistica. Cuando la bacteria se posiciona en los pulmones de los pacientes que padecen fibrosis quistica, es dificil erradicarla debido a que las cepas tienden a formar capas gruesas de biopelicula lo cual agrava la infección, en caso de que el paciente tenga en una etapa avanzada el padecimiento de la fibrosis quistica, las infecciones por Pseudomonas suelen ser de muy alta mortalidad.

Tratamientos y profilaxis (prevención).

*Resistencia y susceptibilidad a antibióticos.
Solo un medico podrá discernir si una cepa bacteriana es resistente o susceptible a algún fármaco, apoyándose en estudios clínicos, antibiogramas bacterianos, estudios genéticos, etc.

**Resistencia: Actualmente existen cepas que son resistentes a fármacos como Ceftiazina, algunas Cefalosporinas, Ciprofloxacino y Carbenicilina.

**Susceptibilidad. Pseudomonas comúnmente son susceptibles a las siguientes familias de antibióticos del tipo penicilicos, como algunas cefalosporinas, fluoroquinolonas, Azlocolina (derivado de un acilo de la ampicilina), Polimixina (Es un un fármaco sintetizado por la bacteria Paenibacillus polymyxa), entre otros.

*Prevención. Para tener baja posibilidad de infección por Pseudomonas sp. los centros de salud y hospitales deben tener una sanitización eficiente de sus áreas casi todos los nosocomios hacen un rol de desinfectantes para disminuir la resistencia de las cepas bacterianas, generalmente en el rol se encuentra el etanol al 70%, soluciones de hipoclorito, formaldehído, ozono desinfectantes comerciales multi-compuestos, así como un monitoreo microbiologico periódico en áreas criticas (principalmente donde se encuentran pacientes inmunocomprometidos.

Hasta la fecha no se a desarrollada un vacuna, la profilaxis con antibióticos no es muy recomendada ya que es posible genrar resistencia en las cepas bacterianas, sin embargo el medico deberá evaluar esta posibilidad.

*Tratamiento. Las heridas se pueden limpiar con desinfectantes como la tintura de yodo, agua oxigenada, pomadas antibacterianas como neomicina, bacitracina, mupirocina, etc.
Generalmente el médico después de hacer los estudios pertinentes sugieren empezar con un tratamiento combinado de aminoglucosidos con penicilicos, aunque todo dependerá de la susceptibilidad bacteriana.

Pseudomonas putida, P. fluorescens.

P. putida

El hábitat de esta bacteria comúnmente es el suelo y zonas acuosas, no es común encontrarlo en pacientes en hospitales, sin embargo si hay casos reportados en particular en USA, Japón, Francia e Italia, Según Molina (6) y su grupo de investigación mencionan que las infecciones están relacionadas con introducción de catéteres o agujas. Las cepas suelen ser resistentes a Betalactamicos.
Las infecciones que causa son muy similares a las que produce P. aeruginosa al igual que os tratamientos para combatirla y su prevención

P. fluorescens

Es menos comun que cause infecciones comparandola con P. aeruginosa y P. putida, sin embargo si llega haber casos clinicos donde P. fluorescens muestra una gran actividad hemolitica en las infecciones causado principlamnete por factores de virulencia como las fosfolipasas.

Bibliografía.

(1) Merino, L. A. (2007), “Pseudomonas aeruginosa: una bacteria con personalidades múltiples”. Rev. argent. microbiol., Ciudad Autónoma de Buenos Aires, v. 39, n. 3, sept. Disponible en <http://www.scielo.org.ar/scielo.phpscript=sci_arttext&pid=S0325-75412007000300004&lng=es&nrm=iso>. accedido en 21 abr. 2015.
(2) Gloria Soberon ; Pseudomonas aeruginosa, Microbios, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, consultado el 16-abr-15. Disponible en:
http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/microbios/Cap3/
(3) Alan R. Hauser and Egon A. Ozer, (2011), “Pseudomonas aeruginosa”, Posters, Cubist Pharmaceuticals, Nature Reviews, Microbiology.
(4) George M. Garrity, (2004), Bergey´s Manual, Of Systemati, Bacteriology, Second Edition.
(5) Pseudomonas spp, “Pathogen Safety data sheet-Infectious Substances”, Public Health Agency of Canada, consultado el 27 de Abril del 2015, disponible en:
<http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/pseudomonas-spp-eng.php>
(6) Molina L, Udaondo Z, Duque E, Fernández M, Molina-Santiago C, et al. (2014) Antibiotic Resistance Determinants in a Pseudomonas putida Strain Isolated from a Hospital. PLoS ONE 9(1): e81604. doi: 10.1371/journal.pone.0081604, Disponible en:
<http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0081604>

Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, K. ozanae. morfologia, medio de cultivo, enfermedades y más

Características Klebsiella.

Klebsiella spp. forma parte de las enterobacterias, son bacilos, Gram (-) negativos, crecen en  diversos medios de cultivo, son bacterias oportunistas, las especies  importantes en la salud del humano son:

  • K. pneumoniae,
  • K. ozanae,
  • K. rhinoscleromatis,
  • K. oxytoca.

Son bacterias de la  flora normal gastrointestinal, sin embargo su importancia médica radica debido  a que son oportunistas(osea se aprovechan del debilitamiento del sistema inmunológico) y pueden producir enfermedades nosocomiales como infecciones  respiratorias, urinarias, neumonías, etc.

Taxonomía bacteriana.

  • Reino: Bacteria
  • Filo: Proteobacteria
  • Clase: Gammaproteobacteria
  • Orden: Enterobacteriales
  • Familia: Enterobacteriaceae
  • Género: Klebsiella

Antecedentes.

En el mundo de la ciencia hay diversas maneras de nombrar a las bacterias, las  tres más comunes son dar nombre por una característica particular, como el  color, la enfermedad que causa, el olor,etc. otra manera es dar el nombre de  quien hizo el descubrimiento o una aportación valiosa, a estas bacterias se le  dio el nombre de un patólogo alemán llamado Theodor Albrecht Edwin Klebs,  debido a sus aportaciones en la bacteriología en 1885 se uso su nombre para  clasificar al género bacteriano “Klebsiella“.

Edwin Klebs (1834-1913) vivió en la época de Pasteur y de Koch y en algún momento trabajo en el laboratorio de R. Koch.
Edwin Klebs (1834-1913) vivió en la época de Pasteur y de Koch y en algún momento trabajo en el laboratorio de R. Koch.

Mas información de Edwin Klebs: Institut für Pathologie der Universität Würzburg.

Edwin Klebs, sus ultimos años
Edwin Klebs, descansando en una silla mecedora durante los últimos años de su vida, este bacteriólogo, murió a causa de la tuberculosis, aunque cabe señalar que tuvo una vida muy longeva casi de 80 años.

Morfología Microscópica Klebsiella spp.

Bacterias con y sin cápsula; un tamaño entre 0.5 μm y 2.0 μm. La morfología microscópica se observa en tinciones de Gram, No forma endoesporas, no tiene flagelo, por lo que es inmóvil.

Klebsiella_Gram negativa
En una tinción de Gram el género Klebsiella se observa de la siguiente manera: Bacilos cortos sin agrupación definida, Gram (-), con o sin cápsula.   By Riraq25, vía Wikimedia Commons

Metabolismo bacteriano.

Son microorganismos facultativos anaerobios, se reproducen mejor  entre 30°C y 37°C . Tienen la enzima de catalasa, ureasa, fermenta muchos  carbohídratos, como la lactosa, por lo tanto son capaces de formar ácidos fuertes en sus procesos metabólicos.

Hábitat en humanos y modo de transmisión.

Klebsiella spp. se puede encontrar en humanos, caballos, cerdos, vacas, entre otros, principalmente en nasofaringe, tracto gastrointestinal, en las heces.

También está presente de forma natural en muchos ambientes acuáticos y puede  multiplicarse y alcanzar concentraciones elevadas en aguas ricas en nutrientes, como residuos de fábricas de papel, plantas de acabado textiles y operaciones de procesado de caña de azúcar. Estos microorganismos pueden proliferar en sistemas de distribución de agua, y se sabe que colonizan las arandelas de los grifos. También son excretados en las heces de muchas personas y animales sanos, y se detectan con facilidad en aguas contaminadas por aguas residuales. Mas información: Organización Panamericana de la Salud 

Medios de cultivo donde crece Klebsiella spp.

Estas bacterias se desarrollan en muchos medios de cultivo, tanto líquidos como sólidos de base agar, entre los que tenemos:

  • Agar nutritivo,
  • Agar Mac conkey,
  • Agar Chocolate.
  • Agar sangre,
  • Caldo o agar infusión cerebro corazón,
  • Caldo o agar soya tripcaseina,
  • etc.

Factores de virulencia.

LPS (Lipopolisacáridos).

Los Lipopolisacáridos se extienden por encima de la capsula de la bacteria de esta manera evita que sean lisadas las paredes celulares bacterianas, en el suero sanguíneo se cuenta con un conjunto de sustancias que se activan en cascada (llamada complemento) una tras hasta formar hoyos en la membrana bacteriana produciendo su lisis y muerte de la bacteria, normalmente el sistema del complemento tiene la capacidad de activarse en la presencia de LPS (principalmente polisacárido de tipo O1), pero como este se encuentra muy prolongado y distanciado de la membrana bacteriana, la activación del complemento es parcial y no logra llegar a la membrana para que surta el efecto deseado, como siempre el efecto del complemento dependerá del tipo de LPS que tenga la bacteria y del tipo de sistema inmune que se tenga.

Fimbrias o pilis (adhesinas).

Para que la bacteria sea capaz de producir una infección tiene que fijarse o sostenerse de las células que estén propensas a infectarse, por ejemplo las células del sistema respiratorio, intestinales o urogenitales. Son estructuras que ayudan a adherirse, estas fimbrias son filamentos cortos y delgados que se encuentran en la superficie de la bacteria.
Hay diferentes tipos de pilis en Klebsiella dos son los más comunes, pili tipo 1 y pili tipo 3.

Cápsula (Polisacáridos).

La cápsula esta compuesta por unidades complejas de azucares y ácidos uronicos, estos últimos proporcionan una carga negativa en la capsula, estas estructuras cubren el contorno de la bacteria en forma de manojos fibrosos. Hay células en el sistema inmune capaces de fagocitar (comerse) a las bacterias es un método de defensa, sin embargo la cápsula bacteriana evita sean fagocitadas por los neutrófilos, monócitos o macrófagos (células fagocitas). Dependiendo del tipo
de azucares y de su secuencia en la cápsula, sera la virulencia, actualmente existen reportadas 77 tipos de serotipos de Klebsiella spp en base a la composición de su capsula.

Capsula bacteriana, Klebsiella pneumoniae
En esta imagen se observa la cápsula translucida de Klebsiella pneumoniae en una tinción de Gram (-), usando un microscopio de contraste de fases.     Flirk/wellcomeimagenes

Sideróforos.

Las bacterias para su desarrollo y reproducción necesitan grandes cantidades de hierro como catalizador para realizar funciones metabólicas fundamentales como reacciones redox y procesos d e trasporte de electrones. La concentración de hierro libre es particularmente bajo en el organismo debido a que la lactoferrina, transferrina, ferritina y hemina se unen al hierro disponible.
Para sobrevivir en el organismo del huesped, Klebsiella spp. genera sustancias capaces  de captar el Hierro entre estas se encuentran la enterobactina (enteroquelina) y la aerobactina.

Infección.

Son patógenos oportunistas y causa infecciones como neumonías, infección del tracto urinario, tracto respiratorio, septicemias o meningitis en neonatos (recién nacidos), principalmente este tipo de padecimientos se adquieren en hospitales (nosocomio).

Prevención.

La bacteria principalmente causa infecciones nosocomiales, su reservorio principal esta en el tracto gastrointestinal, por lo que su prevención radica en tener controles de sanitización eficientes en los hospitales, también el personal como médicos, enfermeros y familiares del paciente deben tener cuidados como un buen lavado de manos.

Resistencia a los antibióticos.

Hay una creciente manifestación de beta-lactamasa producida por algunas cepas de Klebsiella spp, ademas hay algunas que resisten a cefalosporinas en especial a ceftazidima.

Referencia Bibliográfica.

  • (1) George M. Garrity, (2004), Bergey´s Manual, Of Systemati, Bacteriology,
    Second Edition.
  • (2) R. Podschun and U. Ullmann (1998), Klebsiella spp. as Nosocomial Pathogens Epidemiology, Taxonomy, Typing Methods, and Pathogenicity Factors., Clin. Microbiol. Rev, 11(4):589. (http://cmr.asm.org/)

Postulados de Koch, una explicación de que hay enfermedades causadas por microorganismos

Heinrich Hermann Robert Koch (1843-1910) fue un medico alemán, recibió el premio nobel de Medicina y Fisiología en 1905.

Robert_koch_laboratotio_bacteria
Robert Koch, contemplando probablemente la morfología colonial de una bacteria en un medio de cultivo base de agar en una caja petri o simplemente posando para la foto.

R. Koch realizo investigaciones que evidenciaron que la enfermedad del antrax era provocada por el Bacillus Antracis (1870), descubre a las bacterias de la tuberculosis (1882) y el cólera(1883), además fue el primero que logro obtener cultivos bacterianos realmente puros a partir de gelatina y agar solidificados dando entrada al uso de los medios de cultivos de base agar, en ese entonces hasta Pasteur quedo sorprendido, contribuyo a la mejora de los métodos de esterilización en especial la esterilización por calor húmedo, un colaborador llamado Julius Richard Petri desarrollo la “caja Petri” muy usada en el estudio de la microbiología. Continúa leyendo Postulados de Koch, una explicación de que hay enfermedades causadas por microorganismos

Virulencia y Patogenicidad las armas ocultas de las bacterias.

Hola en esta ocasión en microbitos-blog hablaremos de un par de conceptos (Virulencia y Patogenia) que en ocasiones genera confusión debido a que son palabras con significados parecidos. Mostraremos primero las definiciones:

Patógeno:

Microorganismo que puede causar enfermedad.

Patogenia:

El inicio del proceso infeccioso y los mecanismos que inducen el desarrollo de signos y síntomas de la enfermedad.

Patogenicidad:

Un término que se refiere a la capacidad de un patógeno para causar enfermedad.
Capacidad de causar enfermedad mediante la superación de las defensas del huesped.

Virulencia:

El grado o medida de patogenicidad que tienen los microorganismos.

Los factores de patogenicidad (factores de virulencia) son varios y trabajan en conjunto para poder enfermar a la persona o animal, también influye el estado inmunológico de la persona afectada.
En otras palabras la patogenicidad de un microorganismo depende de si es muy virulento o no.

Factores de virulencia mas comunes en bacterias:

Cápsula:

Es una cubierta que se encuentra en la superficie de algunas bacterias, normalmente esta formada por polisacáridos que impiden que sean destruidas por el complemento (conjunto de sustancias del sistema inmune que perfora la membrana celular de la bacteria) o comidas por los fagocitos (células del sistema inmune capaces de comerse a los microorganismos).

Por estas razones es que la cápsula es un factor de virulencia muy importante.

Flagelos:

Son estructuras formadas en su mayoría de proteínas, nos podemos imaginar como la cola de una bacteria, la bacteria se puede mover y alcanzar las celulas para infectarlas o para huir de las células del sistema inmune.

Fimbrias.

Son como hilos delgados constituidos de proteínas (mas pequeños que un flagelo) con estos la bacteria es capaz de sujetarse a las células que va infectar.

Sideróforos:

Son compuestos capaces de captar hierro en la sangre o en las células dañadas del cuerpo, las bacterias ocupan este hierro para crecer y multiplicarse.

Endotoxinas:

También llamadas lipopolisacaridos (LPS) este compuesto se encuentra en la superficie de las membranas celulares de las bacterias en particular de las bacterias Gram (-), a este factor de virulencia se le adjudica casos de fiebre en las personas o animales.

Exotoxinas:

Son sustancias que secretan las baceterias y tienen la capacidad de matar celulas o de producir reacciones bioquimicas en el cuerpo desfavorables causando en algunos casos graves enfermedades; como por ejemplo la toxina botulinica que producen el botulismo (causado por Clostridium botulinium) o la toxina tetanica que genera el tétanos (provocado por Clostridium tetani).

Superantigenos.

Se les llama asi a las toxinas formadas por proteínas, secretadas por algunas bacterias, por ejemplo Staphylococcus aureus y Streptococcus del grupo A, estas toxinas son capaces de trastornar el sistema inmunes produciendo inflamación en muchos tejidos, además de un descontrol de algunos linfocitos, produciendo con esto que la persona entre en shock.

Streptococcus pyogenes, S. agalactiae, S. pneumoniae morfología, medio de cultivo, enfermedades y mas.

Características.

Dentro del género hay muchas especies, siendo las mas importantes desde el  punto de vista clínico: S.pyogenes, S. agalactiae y S. pneumoniae.

Tienen la capacidad de producir enfermedades infecciones en los humanos en especial en las vías  respiratorias altas (garganta faringe) y baja (pulmones), como por ejemplo la faringitis bacteriana, también pueden generar infecciones como la inflamación grave en los pulmones (neumonitis).

Taxonomía bacteriana.

  • Reino: Bacteria
  • Filo: Firmicutes
  • Clase: Bacilli
  • Orden: Bacillales
  • Familia: Streptococcaceae.
  • Género: Streptococcus

Principales especies: Streptococcus pyogenes (grupo A), Streptococcus agalactiae (grupo B), Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans.

Hay ocasiones en la que se agrupan varias especies dependiendo una característica particular y aunque se trata de una pseudotaxonomía son ampliamente aceptadas por ejemplo: Grupo S. Viridans compuesto por S. sanguis, Streptococcus mitis, S. salivarius, S. milleri, S. mutans, entre otras. Generalmente forman parte de la cavidad oral, la mayoría son alfa hemolíticos.

Antecedentes.

Tradicionalmente la clasificación  se ha basado en la reacción hemolítica de la cepa y en el grupo serológico. Este último está determinado por el tipo de polisacárido C presente en la pared celular del microorganismo, denominado antígeno de Lancefield.

 Para distinguir las especies se utilizan  varias metodologías como:

  • Grupo serológico de Lancefield A, B, C, D Y E.
  • Tipo de hemólis alfa, beta y gamma.
  • Pruebas bioquímicas y medios de cultivo.
  • Identificación molecular (ADN).

La identificación mas usada es grupo serológico y pruebas bioquímicas, una combinación de estas da resultados muy precisos. La identificación molecular todavía es una técnica costosa  por lo que no es factible usarla (exceptuando los centros de investigación y algunos hospitales).

Prueba de Lancefield. 

La clasificación de los estreptococcus betahemoliticos del grupo A o grupo B merece ser explicado para que podamos  comprender mejor la clasificación de las especies.  Hace tiempo se tenía la necesidad  de identificar las especies de forma confiable.

Rebecca Craighill  Lancefield  y su grupo de investigaciónrealizo una investigación para resolver esto. A groso modo así es como se realizo su experimento, Lancefield y su grupo de trabajo obtuvo  anticuerpos de suero de  conejos previamente inmunizados con cultivos estandarizados de Streptococcus spp.

 El antígeno provino de la pared celular específicamente de los carbohidratos que la  componen, la forma de este carbohidrato puede variar dependiendo de la especie bacteriana extraído por medio de una solución ácida (preferentemente ácido clorhídrico) y calentamiento. 

El procedimiento simplificado fue el siguiente: se pone el suero de conejo en capilares de vidrio, posteriormente se agrega el extracto del antígeno y se observa si hay o no presencia de  precipitación (reacción antígeno-anticuerpo), de esta manera se empieza a clasificar a las especies de Streptococcus spp.  que generan precipitado con un mismo tipo de antígeno en grupos, Grupo A, B, C, D y E.

Las bacterias patógenas mas comunes para el humano son S. pyogenes (dentro del grupo A) y S. agalactiae (dentro del grupo B) las cuales tienen la característica de ser betahemoliticos; S. pneumoniae la mencionaremos mas adelante.

Tipo de hemólisis en Streptococcus spp.

Otra forma de identificación esta dada por el tipo de ruptura de la membrana celular de los eritrocitos comúnmente llamado lisis de glóbulos rojos, esta es una característica que tienen algunas especies, se observa en un medio de cultivo de base agar con sangre de carnero, cordero, oveja, entre otras.

La clasificación fue mencionada por vez primera por Brown en el año de 1919;  Actualmente las características son las siguientes:

Alfahemólisis

Capacidad de la bacteria para generar una hemólisis parcial que se observa como un zona verde del medio agar (en  esta zona no se observa la coloración verduzca).

La hemolisis es generada principalmente por la estreptolisina S  que  esta en pequeñas cantidades, la cual se desempeña de mejor manera en un ambiente que contenga entre 5 % y 20% de CO2.

Streptococcus-viridans-alfahemolisis
Streptococcus viridans en agar sangre donde se observa la coloración verde sobre la superficie del agar debido a la alfahemólisis de los eritrocitos (glóbulos rojos).

Betahemólisis

Capacidad de la bacteria de realizar una hemólisis total ( es capaz de lisar completamente la membrana de los eritrocitos).

Esta betahemolisis es producida generalmente por S. Pyogenes y S. galactiae, se observa  en  placas de agar sangre sembrada con la técnica de profundidad (hacer picaduras con el asa en las estrías hechas en el agar).

Si la técnica de sembrado se hace por estría en superficie sin la picadura de profundidad la hemolísis puede aparecer débilmente o verse como alfa debido a la inactivación de la estreptolisina O la cual es sensible al oxígeno por lo que se manifiesta de mejor manera en un ambiente que contenga entre 5 % y 20% de CO2, la estreptolisina S es estable al oxigeno solo que puede estar presente en pequeñas cantidades, por lo que las colonias pueden no dar una betahemolísis apreciables.

El medio de cultivo agar sangre no debe de contener alto porcentaje de carbohídratos por ejemplo dextrosa ya que la bacteria lo fermentaría produciendo ácidos que inactiva a la estreptolisina S (hemolítica),  el medio de cultivo que se emplee debe de estar en un pH neutro entre 6.8 y 7.5.

Streptococcus-betahemolisis-agar-sangre
Streptococcus agalactiae con Betahemolisis en medio-de cultivo agar sangre Se observa en la parte izquierda de la placa las zonas translucidas que evidencia la hemolísis total de los eritrocitos (glóbulos rojos).
Streptococcus grupo A y B betahemolisis
La betahemolisis de Streptococcus del grupo A Y B, se logra ver claramente en el medio de cultivo agar sangre en contra luz… La imagen proviene de wikipedia.

Gammahemólisis

Incapacidad de generar hemólisis, en otras palabras la bacteria no es capaz de lisar a los eritrocitos lo cual se  evidencia viendo la placa de agar y su coloración rojiza (no hay cambio en la superficie del medio de cultivo) en todas las zonas donde la bacteria haya crecido.

Morfología Microscópica

En 1869 Hueter afirmó haber visto “cocos en sangre y jugos nutricios” de casos de amigdalitis… En 1874 Billroth público  un grueso libro donde clasificaba las cocáceas en Monococcos, Diplococcos, Streptococcos y Gliococcos, sentando primacía  en la nominación de hoy, con una pequeña modificación latina, llamamos Streptococcus…

estreptococos, Gram(+) agrupados en cadenas
Esta imagen simula a diferentes especies de estreptococos: Cocos Gram(+) agrupados en cadenas largas y cortas.
Cocos en cadenas Gram (+), Wikipedia: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/3f/Streptococcus_iniae.png
Streptococcus spp Cocos en cadenas largas, Gram (+)                    vía: Wiki commons

La morfología microscópica de la bacteria esta implícita en su nombre Strepto-cadena y coccus-cocos, uniendo nos da el significado cocos en forma de cadena, estas cadenas pueden ser cortas o largas y en caso de la especie Streptococcus pneumoniae se presenta en pares o diplococos lanceados, y con cápsula; con un tamaño entre 0.5 μy 1.5 μm.

La morfología microscópica se observa en tinciones de Gram, los Streptococcus spp. se clasifican como Gram (+). No forma  endoesporas, no tiene flagelo por lo que es inmovil.

Metabolismo bacteriano.

Son microorganismos anaerobios facultativos( respiran oxígeno, aunque les gusta más el dióxido de  carbono), se replican eficientemente entre 30°C y 37°C (grados celcius) en una atmósfera entre 5% y 20% con dióxido de carbono (CO2).

Carecen de la enzima catalasa, fermenta varios carbohídratos, como la lactosa, por lo tanto son capaces de formar ácido láctico en sus procesos metabólicos.

Hábitat en humanos y modo de transmisión. 

  • S. pyogenes (grupo A).

Habita en las vías respiratorias superiores, no se consideran parte de la flora normal, pero pudiendo llevarse en la fosa nasal, faringe y raras veces en la mucosa del ano. La transmisión es de persona a persona por contacto directo co secreciones de mucosas o a través de gotitas contaminadas producidas por la tos o los estornudos.

  • S. agalactiae (grupo B).

Forma parte de la flora normal del tracto genital femenino y del tracto gastrointestinal inferior, ocasionalmente pueden colonizar el tracto respiratorio superior.

Las infecciones en los fetos y los recién nacidos  se adquieren por transmisión de persona a persona de la madre en el  útero o durante el parto también puede ser transmitida en hospitales por las manos sucias de la madre o del personal  médico o enfermeras.

Hay ocasiones que en adultos se transmite por manipulación genital y no lavarse las manos o por  practicas sexuales orales en genitales.

  •  S. pneumoniae, Coloniza mucosa nasal y faríngea, siendo su hábitat de preferencia la nasofaringe posterior.(5)

La transmisión ocurre de persona a persona por el contacto de secreciones respiratorias contaminadas con la bacteria, una  sola exposición suele ser suficiente para desarrollar la infección, si coloniza los pulmones puede producir neumonía.

Medios de cultivo donde crece Streptococcus spp.

El genero crece facilmente en cualquier enriquecido, por ejemplo:

  • Agar /caldo infusión cerebro corazón (BHI)
  • Agar/caldo soya tripcaseina (TSA),
  • Agar sangre (AS)
  • Muchos más.

Streptococcus pyogenes (grupo A)

Factores de virulencia.(7)

  • La proteína F media la unión de células epiteliales.
  • Proteína M es antifagocítica.
  • Produce varias enzimas y hemolisinas que contribuyen a la invasión de los tejidos y la destrucción incluyendo:
  • Estreptolisina S.
  • Estreptolisina O.
  • Estreptocinasa.
  • DNAsa
  • Hialuronidasa
  • Exotoxinas pirogénicas que producen la  fiebre escarlata.

Infección

La enfermedad más común causada por S. del grupo A es “infección de la garganta”.

Las infecciones de piel  como el impétigo ó la pioderma, con menos frecuencia, causa infecciones que amenazan la vida tales como septicemia o bacteremia (infección de la sangre), celúlitis (infección en y bajo la piel), faseitis necrótica (destrucción de la grasa  y músculo), fiebre escarlatina, y raramente, el síndrome del choque tóxico.

Toma generalmente de 1 a 3 días para que la enfermedades se desarrollen.

Tratamientos y profilaxis (prevención).

Manteniendo las zonas críticas desinfectadas, Tanto los familiares, paciente y el personal médico deben lavarse las manos  con frecuencia sobre todo cuando manipulen material estéril y pacientes inmunocomprometidos.

Se recomienda no compartir vasos, cucharas o materiales que estén en contacto con saliva o mucosas de enfermos. 

Los  pacientes deberán usar cubre-bocas,toser en su antebrazo y lavarse las manos frecuentemente.Como tratamiento se debe asistir al medico donde lo evaluara y le recetara un antibiótico, se recomienda hacerse un  exsudado faríngeo para que el médico pueda elegir un antibiótico para el cual la bacteria sea sensible.

Streptococcus agalactiae (grupo B).

Factores de virulencia.

El material capsular es Incierto se cree que interfiere con la actividad fagocítica y la activación del complemento de cascada.

Infección.

Las infecciones más comúnmente implican recién nacidos y lactantes, a menudo precedidos por la ruptura prematura de  membranas de la madre.

Las infecciones a menudo se presentan como problemas multisistémicos, incluyendo sepsis, fiebre, meningitis, dificultad respiratoria, letargo e hipotensión.

Las infecciones pueden ser clasificadas como de inicio temprano (se producen los primeros 5 días de vida del bebe) o de aparición tardía (ocurre 7 días a meses después del  nacimiento).

Las infecciones en adultos generalmente son infecciones postparto, como endometritis, cosa que puede provocar  abscesos pélvicos y shok séptico.

Las infecciones en otros adultos suelen reflejar el estado comprometido de la paciente e  incluyen bacteriemia, neumonía, endocarditis, artritis, osteomielitis e infecciones de piel y tejidos blandos.

Tratamientos y profilaxis (prevención).

En el trabajo de parto (5 h o 7 h antes del parto) solo el médico puede administrar penicilina o ampicilina, se ha  demostrado que reduce la transmisión y morbilidad de los neonatos, especialmente de los neonatos prematuros.

Esta  profilaxis solo debe de darse a mujeres portadoras de la bacteria lo cual puede ser determinado por hisopado rectal o vaginal (días o semanas antes del parto).

Streptococcus pneumoniae.

Factores de virulencia.

Es conocida por su patogenicidad  debido principalmente por su cápsula bacteriana la cual le confiere la  capacidad de pasar desapercibida por el sistema inmunológico.

  • Adherencia.
  • Cápsula polisacárida.
  • Pneumolisina.
  • Neuraminidasa.
  • Proteinas de superficie pspA y psaA
  • Autolisina
  • Proteasa para IgA

 Infección. 

Es uno de los principales agentes causales de una gran variedad de cuadros clínicos, infecciones benignas como otitis  media y sinusitis agudas, e infecciones severas como septicemia, meningitis y neumonía.

Tratamientos y profilaxis (prevención).

Las vacunas actualmente disponibles son la vacuna antineumocócica conjugada (PCV7) que es eficaz contra 7 serotipos, y se ha demostrado ser eficaz para los niños de menos de 2 años de edad. La vacuna antineumocócica de polisacáridos (PPV23) es eficaz contra los 23 serotipos de Streptococcus pneumoniae.

 Administrar el tratamiento farmacológico adecuado. Inflamación causada por lisis neumocócica hace que el tratamiento de  las enfermedades neumocócicas menos eficaces con antibióticos solos, e incluso bactericidas muy eficaces tales como β-lactama en realidad puede mejorar los efectos nocivos de la enfermedad en algunos casos.

Sensibilidad a los medicamentos:

Susceptible a la penicilina, tetraciclina, cefotaxima, la levofloxacino, la eritromicina,  y las fluoroquinolonas, especialmente a moxifloxacino y gatifloxacino….susceptibilidad a la telitromicina, vancomicina, linezolid.

Resistencia a las Drogas:

Está emergiendo la resistencia de S. pneumoniae a múltiples fármacos. Presenta una elevada  resistencia a la penicilina, así como a la eritromicina, cefotaxima, levofloxacino, tetraciclina, TMP / SMX, agentes β-lactámicos, macrólidos, cloranfenicol y ceftriaxona, con cepas resistentes a fluoroquinolonas puede ser resistente a la ciprofloxacina y a tratamientos con levofloxacino.

Referencia Bibliográfica.

  • (1) George M. Garrity, (2004), Bergey´s Manual, Of Systemati, Bacteriology, Second Edition.
  • (2) Enferm Infecc Microbiol Clin 2008;26 Supl 13:14-8
  • (3) Lancefield RC (1933), “A serological differentiation of human and other groups of hemolytic Streptococci” JExp Med  57: 571–95.
  • (4) Walter Ledermann (2007), “Una historia personal de las bacterias” Editorial RIL
  • (5) Valerisa Preado, (2001), Conceptos microbiologicos de Streptococcus pneumoniae, Rev. chil. infectol. v.18  s.1 Santiago; Consultado el 15 de Marzo de 2015 en: scielo
  • (6) Virginia Department Of Healht, consultado el 16 de marzo de 2015 en: www.vdh.virginia.gov/epidemiology/factsheets/spanish/Streptococcal.htm
  • (7) Bailey y Scott, (2007), Diagnostic Microbiology, Elseiver, USA.
  • (8) Public Health Agency of Canada, consultado el 19 de marzo de 2015 en: http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-agalactiae-eng.php

Salmonella abony- medio sulfito bismuto

Crecimiento colonial bacteriano de Salmonella spp, en medio de cultivo Sulfito Bismuto
Crecimiento colonial bacteriano, caracteristico de Salmonella spp, en medio de cultivo Sulfito Bismuto. Se observa un crecimeinto abundante y las colonias tienen un reflejo plateado y negro.

Se puede observar el crecimiento característico de Salmonella spp, como el brillo negruzco-metálico del bismuto.

Virus de Epstein- Barr

Familia: Herpesviridae.
Subfamilia: Gammaherpesvirinae.
Genero: Lymphocryptovirus .
Nombre oficial: Herpes virus humano 4.
Nombre común: Virus de Epstein-Barr.
Subtipos (diferencias en los genes de proteínas de latencia):
EBV-1 (tipo A): Occidente
EBV-2 (tipo B): menos virulento.

Capside y envoltura.
Cápside icosaédrica 162 capsómeros triangulares.
Contenido lipídico en la envoltura.
Diámetro: 150-200nm.

Descarga la siguiente presentacion pdf  para mas detalles.  Virus Epstein Barr presentacion PDF

Pruebas bioquímicas primarias: Tinción de GRAM, prueba de catalasa, prueba de oxidasa, prueba de O/F y motilidad.

Las pruebas bioquímicas primarias son usadas para determinar el género de la mayoria de las bacterias.  Actualizado: 2015

  1. Tinción de GRAM.
  2. Prueba de catalasa.
  3. Prueba de oxidasa.
  4. Prueba de oxidación/fermentación conocida como OF.
  5. Motilidad.
Nota: Para identificar el género de las Enterobacterias se usan otras pruebas bioquimicas llamadas IMVIC que se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato.

Tinción de GRAM.

Fue creada en 1884 por el médico danes Hans Christian Gram, Esta tinción nos permite separar a la mayoría de las bacterias en dos grupos las gram positivas que se tiñen de color violeta y las gram negativas que se tiñe de color rosa. La diferencia en la tinción radica en las estructuras de la pared celular de las bacterias.

Pared celular de las bacterias Gram positivas.

Se observa la capa gruesa de peptidoglicano y la ausencia de lipopolisacaridos.Pared celular de las bacterias Gram positivas.
Se puede observar el entrecruzamiento de los acidos teicoicos
Se puede observar el entrecruzamiento de los ácidos teicoicos.

Pared celular de bacterias Gram negativas.

Se observa el lipolisacarido, y la poca cantidad de peptidoglicano.
Se observa el lipopolisacarido, y la poca cantidad de peptidoglicano.
Se observa bajo con tenido de peptido glicano y alto contenido de lipidos en forma de liposacaridos.
Se observa bajo con tenido de péptido glicano y alto contenido de lipidos en forma de lipopolisacaridos.

Reactivos usados en la tinción de Gram.

  • Agua estéril para realizar el frotis.
  • Cristal violeta también conocido como violeta de genciana.
  • Safranina.
  • Una mezcla de alcohol-acetona 1:1.
  • Agua corriente para enjuagar.

Técnica de la tinción de Gram.

De preferencia la tinción debe ser realizada sobre un recipiente para que los desechos sean desechados adecuadamente.

Frotis bacteriano.

  1. Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica hasta el rojo vivo y esperar a que enfríe un poco.
  2. Tomar con el asa una gota de agua estéril y agregarla en un portaobjetos.
  3. Flamear nuevamente el asa  y esperar a que enfríe.
  4. Tomar con el asa un poco de muestra bacteriana a partir de una colonia aislada.
  5. Después agregar la muestra en la gota de agua que esta en el portaobjetos y homogeneizar suavemente con movimientos circulares.
  6. Esperar que seque al aire libre o poner durante uno o dos segundos con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar.

Tinción.

  1. Agregar cristal violeta, solo el suficiente para que se cubra el extendido bacteriano.
    dejar actuar durante 60 segundos.
  2. Agregar el lugol, solo el suficiente, dejar actuar durante 60 segundos.
  3. Enjuagar con agua corriente.
  4. Agregar una o dos gotas de alcohol-acetona e inmediatamente enjuagar con agua corriente.
  5. Agrgar Safranina, solo la suficiente, Dejar actuar durante 60 segundos.
  6. Enjuagar con agua corriente.
  7. Dejar secar a temperatura ambiente.
  8. Observar en un microscopio óptico con un objetivo 100X usando aceite de inmersión.
Resumen de los pasos de la tincion de Gram.
Resumen de los pasos de la tinción de Gram.
Bacilos Gram positivos
Bacilos Gram positivos
Bacilos Gram negativos

Fundamento de la tinción de Gram.

**Los lavados con agua tienen el objetivo de arrastrar mecánicamente el exceso de colorante y quitar el alcohol-acetona.

**El colorante cristal violeta es de naturaleza básica y por lo tanto tiene afinidad por sustancias cargadas negativamente como la pared celular de cualquier bacteria.por lo que bacterias Gram positivas y Gram negativas son teñidas de color violeta.

**Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijación de algún colorante sobre una superficie determinada, en este caso el cristal violeta aumenta su fijación a la pared célular bacteriana usando de mordiente al lugol, en la pared bacteriana el lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua lo que evita que se disuelva y se pierda el colorante durante el enjuague.

Ya sabemos que la pared de los Gram positivos son ricos en ácidos teicoicos no saturados estos muestran gran afinidad por los agentes oxidantes, todos los mordientes por ejemplo el lugol son agentes oxidantes y su efecto en general consiste en dar un caracter mas ácidez de los ácidos teicoicos lo que aumenta la afinidad de estos por el colorante básico cristal violeta.

 **La mezcla de alcohol-acetona es un disolvente orgánico que decolora la pared bacteriana disolviendo el complejo cristal violeta-lugol, esta decoloración no afecta a las bacterias Gram positivas, hay varias explicaciones al respecto, les menciono las dos más aceptadas.
-Una teoría dice: El alcohol-acetona, deshidrata la pared rica en peptidoglicano de los microorganismos grampositivos lo cual cierra los poros de la pared, propiciando una barrera que no permite la salida del complejo cristal violeta-lugol.

En la pared de las bacterias gramnegativas hay poco péptido glicano y una gran cantidad de lípidos estos últimos son disueltos por el alcohol-acetona, lo que permite el escape del complejo cristal violeta-lugol.

-Otra teoría dice: Las bacterias Gram positivas tienen una capa muy gruesa de peptidoglicano con gran cantidad de enlaces entrecruzados de ácidos teicoicos los cuales son poco solubles en alcohol-acetona formando una especie de barrera en la pared bacteriana que no permite la sálida del complejo cristal violeta-lugol por ende se retiene el cristal violeta-lugol en la pared en el proceso de decoloración.

**La safranina es un colorante catiónico que tiñe las paredes bacterianas ya que estas tienen compuestos cargados negativamente, por consiguiente las bacterias Gram negativas se tiñen de color rosa, sin embargo las bacterias Gram positivas no se tiñen debido  a que su pared célular esta saturada del colorante cristal violeta y esto no permite la entrada de la safranina.

Factores que considerar en la tinción de Gram.

–No se debe sobrepasar los tiempos de tinción y decoloración.
–Los cultivos viejos hacen que las bacterias Gram positivas se tiñan parcial o totalmente de color rosa.
–Hay que tomar en cuenta que el agua usada en el frotis se encuentre en el rango de Ph 7-7.8 ya que:
Los grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
Los gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.

DAR CLIC AQUI. Realiza la tinción de Gram de forma interactiva, recuerda realizar correcatamente los pasos. La prueba interactiva pertenece y se obtuvo del: Virtual Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan State University.


Prueba de la oxidasa.

Esta prueba esta basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada citocromoC oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.

Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana, en las siguientes lineas se dara una breve explicación de la cadena respiratoria solo con la finalidad de entender de donde proviene y que realiza la enzima citocromoC oxidasa, entiendase que todo este proceso tiene la finalidad de producir ATP.

En la respiración hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones desde sus sustratos hasta llegar  al citocromoC, la enzima llamada citocromoC oxidasa le quita electrones al citocromoC, estos electrones son transferidos por la enzima al oxígeno siendo este el último aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente debido a que el oxígeno tiene un exceso de electrones puede atraer átomos de Hidrógeno formando dos posibles productos: Agua o peróxido de hidrógeno.

Reactivos usados en la prueba de oxidasa.

Se utilizan colorantes cromógenos que actúan como aceptadores artificiales de electrones que sustituyen de cierta manera al oxigeno usado por la bacteria, los más usados son:

  • Tetrametil-p-fenilendiamina.
  • Dimetil-p-fenilendiamina.
  • Indofenol.

El reactivo basado en una disolución acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%, es el más común y recibe el nombre de reactivo de Kovacs. Este reactivo se puede impregnar en discos o fragmentos de papel filtro grueso. En el comercio ya se venden tiras o discos impregnados con el reactivo.

Fundamento básico: El reactivo de Kovacs es incoloro pero al ponerlo en contacto con la enzima citocromoC oxidasa cambia a un color morado debido a que el  tetrametil-p-fenilendiamina es una amina aromática y la oxidación de esta produce quinolonas de color morado-azulado. Para mayores detalles checa la bibliográfia en especial el libro de Mac Fadin.

Como realizar la prueba de la oxidasa.

  • Se toma con un palillo grueso de madera una muestra bacteriana a partir de una colonia aislada proveniente de un cultivo de 24h.
  • La muestra se pone en contacto con la tira o disco impregnado.
  • Se debe observar una coloración morada en un lapso no mayor a 30segundos para que sea positivo, de lo contrario el resultado es negativo.

Control positivo: Pseudomonas aeruginosa.   Control negativo: Escherichia coli.        


El color azul-morado en el disco de oxidasa es una reaccion positiva.

La carencia de color en el disco se interpreta como oxidasa negativa.
La carencia de color en el disco se interpreta como oxidasa negativa.

Factores a considrerar en  la pueba de oxidasa.

  • No considerar un resultado positivo después de 30 seg  ya que el oxigeno molecular del ambiente oxida al reactivo.
  • No usar asa bacteriológica metálica ya que la mayoría de estas con tienen hierro y este es capaz de oxidar el reactivo dando nos falsos positivos.
  • No realizar la prueba de bacterias que provienen de colonias obtenidas de medios de cultivos que contienen glucosa u otro carbohidrato ya que la fermentación del carbohidrato inhibe a la oxidasa dando como resultado falsos negativos en la prueba.
  • Para realizar la prueba usar bacterias provenientes de medios de cultivo como son: Agar sangre, Agar BHI, agar tripticasa soya, agar nutritivo, agar Mueller Hinton.

Realiza de forma interactiva la prueba de oxidasa. La prueba interactiva pertenece y se obtuvo del: Virtual Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan State University.  http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/oxidase/oxidase_test/index.html


Prueba de la catalasa.

Prueba de catalasa Realiza la prueba de catalasa de forma interactiva. La prueba interactiva pertenece y se obtuvo del: Virtual Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan State University.

Fundamento de la pruebe de catalasa.

 El peróxido de hidrógeno es el producto final del metabolismo oxidativo de carbohidratos, a esta vía metabólica recibe el nombre de metabolismo aerobio-oxidativo.

La acumulación del peróxido es muy toxico por lo que la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas exceptuando a Streptococcus sp.  producen una enzima llamada catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno obteniendo agua y oxigeno gas.

Técnica e interpretación de la prueba.

El reactivo utilizado en la prueba es el peróxido de hidrogeno al 30%, Hay diferentes técnicas para realizar la prueba la mas común es poner una gota de peróxido en el portaobjetos y posteriormente con un palillo plano tomar un poco de bacteria a partir de una colonia aislada, si se observa el burbujeo generalmente intenso significa que hay producción de oxígeno por lo tanto se entiende que hay presencia de la enzima catalasa., hay bacterias que dan una reacción positiva debil aunque son las menos.

Reacción de la catalsa.
Control  positivo:  Stahylococcus aureus
Control  negativo:  Streptococcus pyogenes
 
Burbujeo catalasa positivo, carencia de burbujeo catalasa negativo.
Burbujeo catalasa positivo, carencia de burbujeo catalasa negativo.

Prueba de oxidación y fermentación también conocida como OF.

Las bacterias ocupan diferentes vías metabólicas para obtener sus nutrientes y la energía, casi todas las bacterias consumen algún tipo de carbohidrato generalmente el mas utilizado por las bacterias es la glucosa, usan la vía oxídativa, fermentativa o ambas.

La vía  oxidativa utiliza oxígeno, un sinónimo es vía aerobia. El metabolismo fermentativo no utiliza oxigeno, sinónimo metabolismo anaerobio.

Ingredientes del medio OF.
Peptona. 2g
NaCl. 5g
D-glucosa. 10g
Azul de bromotimol. 0.03g
Agar. 3g
Fosfato dipotasico. 0.3g
Agua. 1000m

Ph debe ser 7.1, que dara un color verde en la preparación.


Fundamento de la prueba bioquímica de OF.

El metabolismo oxídativo de la glucosa produce ácidos débiles, por lo tanto en la prueba bioquímica se utiliza de indicador el azul de bromotimol que tiene un vire de ph menor respecto al rojo de fenol, ya que son ácidos débiles se agrega una mayor cantidad de glucosa hasta el 1%,  para que se produzca una mayor cantidad de ácidos y se alcance mas fácilmente el vire del indicador.

El metabolismo de las peptonas produce sustancias alcalinas que podrían disminuir el Ph del medio evitando así evidenciar la presencia de los ácidos débiles producidos por la via oxidativa, para solucionar esto el medio tiene poca cantidad de peptonas hasta el 2% respecto a la D-glucosa.

Ph de vire del azul de bromotimol:  6-7 
Ácido: Amarillo   Alcálino: Verde.

En el tubo sin aceite: La producción de ácidos débiles reduciría el ph del medio esto será evidenciado gracias al indicador produciéndose una coloración amarilla en todo el tubo, aunque puede variar su intensidad.

En el tubo con aceite: La fermentación de la glucosa produce ácidos fuertes respecto a los que produce la vía oxidativa, ejemplo de estos ácidos son el ácido láctico, ácido fórmico, ácido acético, entre otros. El medio se acidifica y el vire del indicador da como resultado una coloración amarilla intensa en la totalidad del tubo.

Técnica de la prueba.

Se van a usar dos tubos, utilizando un asa recta la cual se flamea en el mechero, se puede enfriar en agar estéril, después se toma un poco de bacteria a partir de una colonia aislada posteriormente se inoculan ambos tubos por el método de picadura y finalmente se preparan las condiciones de los tubos;

Un tubo se cerrara su tapa de tal forma que quede floja con la intención de que entre algo de oxigeno, al segundo tubo se le agregara 1.5-2ml de aceite mineral estéril y la tapa se cerrara completamente, se incubarán durante 24h.

Inoculación por picadura.

Interpretación y lectura de la prueba bioquímica de OF.

Ambos tubos verdes se interpreta como OF: sin crecimiento o no consume glucosa. segun sea el caso.
Ambos tubos verdes se interpreta como: negativo  o no sacarolitico debido a que no consume glucosa.
Interpreatcion de tubos amarillo, amarillo fermentador facultativo y se reporta como, OF: F
Interpreatción de tubos amarillo, amarillo: Fermentador facultativo y se reporta como:  F
Cuando el tubo abierto es amarillo y el tubo con aceite es verde se interpreta como reacción oxidativa y se reporta como OF: O:
Cuando el tubo abierto es amarillo y el tubo con aceite es verde se interpreta como reacción oxidativa y se reporta como:  O

Control positivo oxidativo: Pseudomonas aeruginosa
Control positvo fermentador: Escherichia coli
Control sin cambios, no consume glucosa: Moraxella sp


Prueba de motilidad.

La motilidad se puede observar por un crecimiento turbio lejos de la picadura realizada en la inoculación de los medios OF o en un medio SIM, este método es de confianza variable ya que la picadura se pudo haber hecho chueca o irregular lo que nos  darian falso positivo. Para evitar este factor se realiza la técnica de gota suspendida bacteriana.

Técnica de gota suspendida: Agregar sobre un portaobjetos una gota de solución fisiológica salina estéril, ponerle un poco de muestra bacteriana, homogeneizar de tal forma que la gota no se extienda mucho, ponerle encima un cubreobjetos al que previamente se le a puesto una base de 4 bolitas pequeñas de plastilina con el objetivo de evitar que aplaste totalmente la gota con bacteria, finalmente observar al microscopio con un objetivo de 40X.

Se alcanzan haber bacterias muy pequeñas y casi translúcidas moverse a velocidad variable, observar al menos de 5-10 bacterias recorrer todo el campo de visión para declarase una motilidad positiva. La mayoría de las bacterias motiles son de morfología bacilar o sea Bacilos., Pero no todos los bacilos son motiles.

Bibliografía consultada.

–Koneman, Diagnostico bacteriológico, texto y atlas a color, 6ed, Panamericana, Argentina, 2006.

–MacFadin, Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica, 3ed, Panarmericana, Argentina, 2003.

–Bailey y Scott, Diagnostico bacteriológico, 12ed Panamericana, Argentina, 2007.

Imágenes caldo rojo de fenol.

El caldo rojo de fenol es usado para  observar la fermentacion de algún carbohidrato como puede ser maltosa, glucosa, sacarosa, lactosa, trealosa, etc. El caldo rojo de fenol solo lleva un carbohidrato a la vez.

Ingredientes basicos:

Peptona de caseina, 12g
Extracto de carne, 1g
Cloruro sódico, 5g
Rojo fenol, 0.018g
Carbohidrato,10g
Agua destilada, 1000ml

El caldo debe estar a Ph 7.4 , el color del caldo queda  naranja-rojizo.

Despues de haber inoculado el caldo con la bacteria y haber incubado 24h la forma de leer la prueba es la siguiente:

Si hay fermentación del carbohidrato el caldo tornara de color amarillo, puede observarse gas en forma de burbujas, estas burbujas se pueden ver mucho mejor en una campana de Durham, esta campana es un tubito que se encuentra boca-abajo en el fondo del tubo del caldo rojo de fenol. Si no hay fermentación el caldo tiene una coloracion naranja-rojiza.

Este fenómeno se basa en que el metabolismo de la fermentación produce ácidos medianamente fuertes como el ácido acético, acido fórmico, ácido lactico, ácido malico, entre otros, esto depende del tipo de carbohidrato que se ponga en el caldo. El rango de ph del indicador rojo de fenol es: 6.8 – 8.4, esto nos dice que a Ph de 6.8 o menos el medio esta ácido y el indicador cambia a color amarillo y si el ph es de 8.4 o mas el medio esta básico y el color se mantiene naranja-rojizo.

El tamaño de los tubos donde se ponga el caldo pueden ser grandes o pequeños todo depende del tipo de prueba que se vaya hacer.

En las imagenes siguientes los tubos son de diferentes tamaños y  concentraciones de caldo, además tienen campana de Durham para observar facilmente la presencia de gas, estos tubos se ocupan para pruebas semicuantitativa para bacterias coliformes. Pero el fundamento es el mismo para cualquier tipo de caldo con rojo de fenol con carbohidrato.

Se observa la fermentación ya que el caldo cambio a color amarillo, en este caso el carbohidrato es lactosa, sin embargo cualquier carbohidrato fermentado en este caldo se ve igual. Tambien se puede ver la presencia de gas en forma de burbujas que se encuentra en el fondo dentro de la campana de Durham.
No se observa fermentación del carbohidrato por lo tanto el color naranja-rojizo no cambio.